암 특이적 메틸화 시그니처를 이용한 대장암 및 진행성 선종의 진단

1. 연구 배경

   1.1 대장암의 진단 대장암은 소화관에 생기는 흔한 악성종양이다. 2015년 통계에 따르면 중국에서 대장암의 이환율과 사망률은 모두 모든 암 중 상위 5위에 속합니다. 연구에 따르면 환자가 종양 세포가 퍼지기 전에 진단을 받으면 환자의 5년 생존율이 90%에 달할 수 있습니다. 그러나 현재 환자의 40%만이 초기 단계에서 진단됩니다. 따라서 대장암에 대처하기 위해서는 질병 초기에 치료하는 것이 필수적이다. 진단을 위해 임상적으로 사용되는 주요 방법은 대장내시경입니다. 이 방법은 정확하지만 설사, 장 천공과 같은 많은 요인에 의해 제한되며 검사 전에 여러 가지 방법으로 준비해야 합니다. 환자는 유동식을 먹고 장을 청소해야 합니다. 영상, 조직병리학적 검사와 같은 다른 진단 방법은 검출률이 낮거나 장기 손상을 유발합니다. 따라서 대장암을 조기에 발견하는 것은 여전히 ​​어려운 과제입니다.

   1.2 대장암 환자 및 임상 연구에서 ctDNA 메틸화의 검출 후성유전학은 DNA의 1차 서열의 변화 없이 유전 가능한 표현형 변화를 의미합니다. DNA 메틸화는 염색질 구조 및 DNA 안정성의 변화를 일으키고 유전자 전사 및 발현을 조절할 수 있는 후성적 변형 경로 중 하나입니다. 연구에 따르면 DNA 메틸화는 종양의 발생 및 발달과 밀접한 관계가 있음이 밝혀졌습니다. DNA 메틸화 변화는 정상 세포와 비교하여 종양 세포의 수많은 DNA 부위에서 발생합니다. 추가 연구에 따르면 DNA 메틸화는 암 진행 초기에 발생하여 암의 조기 스크리닝을 위해 DNA 메틸화를 사용할 수 있습니다.

   Nature Genetics에 게재된 Kun Zhang 교수의 연구 논문을 기반으로 Singlera Genomics Inc.는 독점적인 methyl-Titan 시퀀싱 기술을 발명하고 대장암 및 진행성 선종(Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE)에 대한 검출 방법을 개발했습니다. ACE는 혈액 기반 비침습적 진단 기술입니다. 대장내시경에 비해 순응도가 높고 대변검사보다 검체채취가 편리합니다. 또한 기존 혈액 검사법에 비해 감도가 훨씬 높다. 이러한 장점을 바탕으로 ACE 기술은 대장암 조기 진단에 적합합니다.

   개발 단계에서 Singlera Genomics Inc.는 게놈의 400만 CpG 메틸화 부위에 대해 고처리량 및 고커버리지 스크리닝 방법을 사용했으며, 대장암 스크리닝을 위해 대장암, 선종, 용종 조직 샘플 및 짝을 이룬 정상 조직의 여러 단계를 분석했습니다. - 관련 메틸화 사이트. 암 환자와 건강한 사람의 혈장 샘플도 분석하여 대장암에 대한 ctDNA 메틸화 마커를 선택했습니다.

   이번 연구에서는 ACE법을 이용해 혈액 내 ctDNA에서 암 특이적 DNA 메틸화 마커를 분석해 대장암과 선종 환자의 감별진단에 도움을 줄 계획이다. 이 기술은 의심 환자의 진단에 대한 불편함을 크게 줄이고 대장암 고위험 집단의 진단을 향상시킬 것입니다. 높은 검출률은 대장암의 조기 발견 및 조기 치료에 도움이 되어 의료비를 효과적으로 절감하고 환자의 생존율을 향상시킬 것입니다.

2. 연구 목표

   2.1. 주요 목표 대장암 및 선종의 보조 진단을 위한 혈장 ctDNA 메틸화 시퀀싱 기술을 기반으로 하는 검출 시스템을 구축합니다. 결장직장암 및 선종에 대한 혈장 ctDNA 메틸화 시그니처의 진단적 가치를 평가합니다.

   2.2. 2차 목표 혈장 ctDNA 메틸화 신호와 결장경 검사 결과 및 수술 표본의 병리학적 결과의 연관성을 평가합니다.

3. 연구개요

   3.1 연구 설계 및 계획 이 연구는 전향적이고 개방적이며 통제된 다기관 연구였습니다. 등록된 샘플에는 양성 그룹(결장직장암 I-IV기, 진행성 선종 포함) 및 음성 그룹(비진행성 선종, 음성 병리학적 검사를 받은 환자, 음성 대장내시경 결과를 가진 건강한 사람, 양성 증식증 및 이형성증이 없는 염증성 대장 질환 포함)이 포함됩니다. ). 표본 크기는 양성 사례 700개, 음성 사례 600개입니다.

   3.2 사례 수 및 그룹화 계획 이 실험은 1300명의 피험자를 등록하여 두 그룹으로 할당할 계획입니다. 양성군은 대장암(1기~4기) 300예, 진행성 선종(고도 이형성증, 융모선종, 관상선종, 톱니모양 병변 등) 400예를 포함한다. 음성군(총 600건)은 진행되지 않은 선종(크기≤10mm, 100건 이상), 염증성 대장질환, 양성 증식증, 조직병리학적 소견상 종양이 없는 환자 및 정상인을 포함한다.

   3.3 조사절차

   3.3.1 환자 선별 연구자는 각 피험자에게 기본 정보, 병력, 가족력, 약물 병력 및 관련 임상 시험 참여 여부를 물어 포함 기준을 충족하는지 판단합니다. 기록에 따라 포함 기준을 충족하는 피험자는 먼저 단순 양성 그룹과 음성 그룹으로 나뉩니다. 등록된 각 환자에 대해 정보에 입각한 동의서가 서명됩니다.

   초기 그룹화를 완료한 모든 피험자는 대장 내시경 및 임상 관리를 받기 전에 말초 정맥혈을 채취합니다. 혈액 샘플 20ml를 ctDNA 검출 혈장 분리 요건에 따라 원심분리합니다. 상청액 혈장을 수집하고 즉시 냉장 보관합니다.

   3.3.2 임상 검사 대장 내시경은 모든 피험자에게 시행됩니다(외과적 병리 결과가 있는 피험자는 제외). 장 병변이 있는 환자의 경우 양성인지 음성인지 확인하기 위해 대장내시경 검사를 시행합니다. 외과적 절제가 필요한 양성 환자는 외과적 조직병리학적 결과에 따라 추가로 분류됩니다. 음성 환자의 경우 병변 유형을 명확히 해야 합니다.

   3.3.3 ACE 테스트 특정 그룹에 할당된 피험자의 모든 혈장 샘플은 Shanghai Singlera Genomics Inc.(No. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai)로 이송됩니다. cfDNA는 환자 혈장에서 추출되고 암 특이적 DNA 메틸화 프로필이 분석됩니다. 혈장 ctDNA 메틸화 검사 결과에 따라 등록된 피험자의 대장암 위험도를 점수화하고 그룹화 정보와 결합하여 조기 암 및 선종 진단을 위한 ctDNA의 암 특이적 메틸화 프로필의 임상적 적용 가치를 평가합니다.

   3.4 종점 결정 수술적 조직병리학적 검사 결과에 따라 양성 피험자를 결정합니다. 음성 과목은 대장 내시경 결과에 따라 결정됩니다.

   ctDNA 메틸화 프로필은 양성 및 음성 대상에 대해 분석됩니다.

4. 통계 분석

4.1 샘플 크기 추정 이 연구의 결과는 말초 혈액 ctDNA의 결장직장암 특이적 메틸화 신호입니다. 메틸화 신호는 모두 특정 가중치로 중첩되며 최종 점수는 단일 숫자 형식입니다. 우리의 예비 결과는 대조군(μ1)의 평균값이 0.36이고 테스트 그룹(μ2)의 평균값이 0.73인 것으로 나타났습니다. 그룹 간의 평균 차이는 δ = μ2 - μ1= 0.37이었고 전체 샘플 표준 편차 s의 표준 편차 σ는 0.42입니다. 양쪽에서 검사 수준 α를 0.005로 설정합니다. 검증 성능 β는 0.005이고 t 값 테이블을 쿼리하여 t(α) = 2.807, t(β) = 2.576을 얻습니다.

다음 공식은 샘플 크기를 계산하는 데 사용됩니다.

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

계산된 결과는 n = 74.68, 75로 반올림됩니다. 등록된 샘플의 사용 불가능한 사례가 25%일 수 있음을 고려하여 최소 테스트 그룹 샘플 크기는 100개 사례로 설정되었습니다.

양성 그룹 1, 대장암 I-IV기, 각 하위 범주에 그룹을 할당할 필요가 없습니다. 다른 그룹 간의 샘플 수 균형을 고려하여 샘플 크기는 300 케이스로 설정됩니다.

양성 2군인 진행성 선종은 "대장직장암 진단 및 치료 지침"에 따라 진행성 선종을 4가지 범주로 분류한다. 총 400건에 대해 범주당 평균 100건으로 서로 다른 범주에 균등하게 분배할 필요가 없습니다.

부정적인 그룹은 세 가지 범주로 나뉩니다. 진행되지 않은 선종은 양성 그룹 2의 양성 선종과 구별되어야 하며 최소 표본 크기는 100건이 필요합니다. 다른 범주에는 특정 샘플 크기가 필요하지 않습니다. 다른 그룹과의 균형을 고려하여 표본 크기는 총 600건으로 설정됩니다.

4.2 통계 및 데이터 분석 각 샘플에 대한 시퀀싱 데이터는 시퀀싱 데이터가 미리 설정된 수준에 도달하는지 여부를 포함하여 다양한 매개 변수를 사용하여 시퀀싱 품질에 대해 평가되었습니다. Q30 값이 수용 가능한지 여부; CpG 사이트가 균형을 이루고 있는지 여부, 적용 범위가 표준인지 여부, amplicon 시퀀싱 깊이가 예상대로인지 여부 및 시퀀싱 균일성이 허용 가능한지 여부.

시퀀싱 결과의 암 특이 적 DNA 메틸화 신호는 이전 연구에서 확립된 모델에 따라 요약 및 분석됩니다. 각 신호 값은 특정 가중치로 중첩되어 각 샘플에 대한 메틸화 점수를 얻습니다. 각 샘플의 그룹화 정보와 결합하여 각 샘플에 대해 PCA, 클러스터링 및 기타 분류 분석을 수행합니다. 메틸화 신호는 결장직장암/선종 위험 점수로 변환됩니다.

음성군과 양성군 간의 위험 점수 차이를 기반으로 민감도, 특이도, 양성 예측값을 계산하고 혈장 ctDNA에서 암 특이적 메틸화 신호의 임상적용 효능을 평가한다.