Diagnoza raka jelita grubego i zaawansowanego gruczolaka przy użyciu sygnatur metylacji specyficznych dla raka

1. Badania tle

   1.1 Rozpoznanie raka jelita grubego Rak jelita grubego jest częstym nowotworem złośliwym przewodu pokarmowego. Według statystyk z 2015 roku zarówno zachorowalność, jak i śmiertelność z powodu raka jelita grubego w Chinach plasuje się w pierwszej piątce wszystkich nowotworów. Badania wykazały, że pięcioletnie przeżycie pacjentów może osiągnąć 90%, jeśli pacjenci zostaną zdiagnozowani przed rozprzestrzenieniem się komórek nowotworowych. Jednak tylko 40% pacjentów jest obecnie diagnozowanych we wczesnym stadium. Dlatego leczenie we wczesnym stadium choroby jest niezbędnym sposobem radzenia sobie z rakiem jelita grubego. Główną metodą stosowaną klinicznie do diagnozy jest kolonoskopia. Metoda ta jest dokładna, ale ograniczona wieloma czynnikami, takimi jak biegunka, perforacja jelit i wymaga wielorakiego przygotowania przed badaniem. Pacjenci muszą stosować płynną dietę, oczyszczać jelita itp. Inne metody diagnostyczne, takie jak obrazowanie, badanie histopatologiczne mają niską wykrywalność lub powodują uszkodzenie narządu. Dlatego wykrycie raka jelita grubego we wczesnym stadium jest wciąż trudnym zadaniem.

   1.2 Wykrywanie metylacji ctDNA u pacjentów z rakiem jelita grubego i badania kliniczne Epigenetyka odnosi się do dziedzicznej zmiany fenotypowej bez zmiany pierwotnej sekwencji DNA. Metylacja DNA jest jednym ze szlaków modyfikacji epigenetycznych, które mogą powodować zmiany w strukturze chromatyny i stabilności DNA oraz regulować transkrypcję i ekspresję genów. Badania wykazały, że metylacja DNA ma ścisły związek z występowaniem i rozwojem nowotworów. Zmiany metylacji DNA występują w wielu miejscach DNA w komórkach nowotworowych w porównaniu z normalnymi komórkami. Dalsze badania pokazują, że metylacja DNA zachodzi na wczesnym etapie procesu nowotworowego, co umożliwia wykorzystanie metylacji DNA do wczesnych badań przesiewowych raka.

   Na podstawie artykułu naukowego opublikowanego przez profesora Kun Zhanga w Nature Genetics, firma Singlera Genomics Inc. wynalazła zastrzeżoną technologię sekwencjonowania metylo-tytanu i opracowała metodę wykrywania raka jelita grubego i zaawansowanego gruczolaka (wczesne wykrywanie gruczolaka/raka jelita grubego, ACE). ACE to nieinwazyjna technika diagnostyczna oparta na krwi. Ma wysoki wskaźnik zgodności w porównaniu z kolonoskopią, a pobieranie próbek jest wygodniejsze niż badanie kału. Ma również znacznie wyższą czułość w porównaniu z istniejącymi metodami badania krwi. Dzięki tym zaletom technologia ACE nadaje się do wczesnego wykrywania raka jelita grubego.

   Na etapie opracowywania firma Singlera Genomics Inc. zastosowała wysokoprzepustową metodę przesiewową o dużym zasięgu dla 4 milionów miejsc metylacji CpG w genomie i przeanalizowała różne stadia raka jelita grubego, gruczolaka, próbki tkanek polipów i sparowane normalne tkanki w celu przesiewowego raka jelita grubego -powiązane miejsca metylacji. Analizie poddano również próbki osocza od pacjentów z rakiem i osób zdrowych, aby wybrać markery metylacji ctDNA dla raka jelita grubego.

   Obecne badanie planuje wykorzystanie metody ACE do analizy ctDNA we krwi pod kątem specyficznych dla raka markerów metylacji DNA, aby pomóc w diagnostyce różnicowej pacjentów z rakiem jelita grubego i gruczolakiem. Technika ta znacznie zmniejszy dyskomfort w diagnostyce pacjentów z podejrzeniem raka jelita grubego i poprawi diagnostykę populacji wysokiego ryzyka raka jelita grubego. Wyższy wskaźnik wykrywalności jest korzystny dla wczesnego wykrywania i wczesnego leczenia raka jelita grubego, co skutecznie obniży koszty leczenia i poprawi przeżywalność pacjentów.

2. Cele badawcze

   2.1. Główne cele Stworzenie systemu detekcji opartego na technologii sekwencjonowania metylacji ctDNA osocza do diagnostyki pomocniczej raka jelita grubego i gruczolaka; Ocena wartości diagnostycznej sygnatury metylacji ctDNA osocza dla raka jelita grubego i gruczolaka.

   2.2. Cele drugorzędne Ocena związku sygnałów metylacji ctDNA osocza z wynikami kolonoskopii i patologicznymi wynikami próbek chirurgicznych.

3. Przegląd badań

   3.1 Projekt i planowanie badania To badanie było prospektywnym, otwartym, kontrolowanym, wieloośrodkowym badaniem. Zakwalifikowane próbki zawierają grupę dodatnią (m.in. rak jelita grubego w stadium I-IV, zaawansowany gruczolak) oraz grupę ujemną (gruczolak niezaawansowany, pacjenci z ujemnym wynikiem badania histopatologicznego, osoby zdrowe z ujemnym wynikiem kolonoskopii, łagodny rozrost i zapalna choroba jelita grubego bez dysplazji) ). Wielkość próby to: 700 przypadków pozytywnych i 600 przypadków negatywnych.

   3.2 Liczba przypadków i schemat grupowania W tej próbie planuje się zapisać 1300 osób, które zostaną podzielone na dwie grupy. Grupa dodatnia obejmuje 300 przypadków raka jelita grubego (stopień I-IV) i 400 przypadków zaawansowanego gruczolaka (dysplazja dużego stopnia, gruczolak kosmków, gruczolak kanalikowy, zmiany ząbkowane itp.). Grupa ujemna (łącznie 600 przypadków) obejmuje: niezaawansowane gruczolaki (wielkość ≤10 mm, nie mniej niż 100 przypadków), zapalną chorobę jelita grubego, łagodny rozrost, pacjentów bez guza po badaniu histopatologicznym oraz osoby zdrowe.

   3.3 Procedura badawcza

   3.3.1 Badanie przesiewowe pacjentów Badacz zapyta każdego badanego o podstawowe informacje, historię choroby, wywiad rodzinny, historię leczenia oraz czy brał udział w powiązanych badaniach klinicznych, aby określić, czy spełnia kryteria włączenia. Na podstawie ich zapisów badani, którzy spełniają kryteria włączenia, są najpierw dzieleni na prostą grupę pozytywną i grupę negatywną. Dla każdego zapisanego pacjenta zostanie podpisany formularz świadomej zgody.

   Wszyscy pacjenci, którzy ukończą początkową grupę, będą mieli pobraną krew z żył obwodowych przed poddaniem się kolonoskopii i leczeniu klinicznemu. 20 ml próbki krwi odwirowuje się zgodnie z wymogami separacji osocza detekcyjnego ctDNA. Supernatant osocza zbiera się i natychmiast chłodzi.

   3.3.2 Badanie kliniczne Kolonoskopia jest wykonywana u wszystkich pacjentów (z wyjątkiem tych, u których uzyskano wynik patologii chirurgicznej). W przypadku pacjentów ze zmianami jelitowymi wykonuje się kolonoskopię w celu ustalenia, czy są one dodatnie, czy ujemne. Pacjenci z pozytywnym wynikiem, którzy wymagają resekcji chirurgicznej, zostaną dalej sklasyfikowani zgodnie z ich chirurgicznymi wynikami histopatologicznymi. W przypadku pacjentów z wynikiem ujemnym należy wyjaśnić rodzaj zmiany.

   3.3.3 Test ACE Wszystkie próbki osocza osób przydzielonych do określonych grup są transportowane do firmy Shanghai Singlera Genomics Inc. (nr 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Szanghaj). cfDNA jest ekstrahowany z osocza pacjenta i analizowany jest specyficzny dla raka profil metylacji DNA. Zgodnie z wynikami testu metylacji ctDNA w osoczu ocenia się ryzyko raka jelita grubego u włączonych pacjentów i łączy z informacjami dotyczącymi grupowania w celu oceny wartości zastosowania klinicznego profilu metylacji specyficznego dla raka w ctDNA we wczesnej diagnostyce raka i gruczolaka.

   3.4 Określenie punktu końcowego Osoby z wynikiem dodatnim określa się na podstawie wyników chirurgicznego badania histopatologicznego; osobniki negatywne określa się na podstawie wyników kolonoskopii.

   Profil metylacji ctDNA jest analizowany dla osobników pozytywnych i negatywnych.

4. Analiza statystyczna

4.1 Oszacowanie wielkości próby Wyniki tego badania to specyficzne dla raka jelita grubego sygnały metylacji z ctDNA krwi obwodowej. Wszystkie sygnały metylacji zostaną nałożone z określoną wagą, a końcowy wynik jest w postaci pojedynczej liczby. Nasze wstępne wyniki wykazały, że średnia wartość grupy kontrolnej (μ1) wyniosła 0,36, a średnia wartość grupy testowej (μ2) wyniosła 0,73. Średnia różnica między grupami wynosiła δ = μ2 - μ1 = 0,37, odchylenie standardowe σ ogólnego odchylenia standardowego s wynosi 0,42. Ustaw poziom kontroli α na 0,005 po obu stronach. Wydajność weryfikacji β wynosi 0,005, a tabela wartości t jest przeszukiwana w celu uzyskania t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

Do obliczenia wielkości próby stosuje się następujący wzór:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Obliczony wynik to n = 74,68, co zaokrągla się do 75. Biorąc pod uwagę, że zarejestrowane próbki mogą zawierać 25% przypadków bezużytecznych, minimalna wielkość próby grupy testowej została ustalona na 100 przypadków.

Grupa dodatnia 1, rak jelita grubego w stadium I-IV, nie ma potrzeby przydzielania grup do każdej podkategorii. Biorąc pod uwagę równoważenie liczby próbek między innymi grupami, wielkość próby ustalono na 300 przypadków.

Pozytywna grupa 2, zaawansowany gruczolak, zgodnie z „Wytycznymi dotyczącymi rozpoznawania i leczenia raka jelita grubego”, zaawansowane gruczolaki są podzielone na cztery kategorie. Nie ma potrzeby równego podziału na różne kategorie, ze średnią 100 spraw na kategorię, co daje w sumie 400 spraw.

Grupa negatywna jest podzielona na trzy kategorie. Niezaawansowane gruczolaki należy odróżnić od dodatnich gruczolaków w dodatniej grupie 2 i wymagać minimalnej wielkości próby wynoszącej 100 przypadków. Inne kategorie nie wymagają określonej wielkości próby. Biorąc pod uwagę równowagę z innymi grupami, wielkość próby ustalono na łącznie 600 przypadków.

4.2 Statystyka i analiza danych Dane sekwencjonowania dla każdej próbki oceniono pod kątem jakości sekwencjonowania przy użyciu różnych parametrów, w tym tego, czy dane sekwencjonowania osiągają zadany poziom; czy wartość Q30 jest akceptowalna; czy miejsce CpG jest zrównoważone, czy pokrycie jest zgodne ze standardami, czy głębokość sekwencjonowania amplikonu jest zgodna z oczekiwaniami i czy jednorodność sekwencjonowania jest akceptowalna.

Sygnały metylacji DNA specyficzne dla raka w wynikach sekwencjonowania są podsumowywane i analizowane zgodnie z modelem ustalonym w naszych poprzednich badaniach. Na każdą wartość sygnału nakłada się określoną wagę, aby uzyskać wynik metylacji dla każdej próbki. W połączeniu z informacjami o grupowaniu każdej próbki, dla każdej próbki przeprowadzane są analizy PCA, grupowania i inne analizy klasyfikacyjne. Sygnały metylacji są następnie przekształcane w ocenę ryzyka raka jelita grubego/gruczolaka.

W oparciu o różnice w punktacji ryzyka między grupą ujemną a grupą dodatnią oblicza się czułość, swoistość i przewidywane wartości dodatnie oraz ocenia się skuteczność zastosowania klinicznego specyficznego dla nowotworu sygnału metylacji w ctDNA osocza.