정신분열증에서 DISC1 유전자의 돌연변이 선별 및 전좌 검출

보조금 제안에는 두 가지 주요 연구 목표가 있습니다. 첫 번째 목표는 염색체 1q42.1 및 11q14.3의 각 700bps에서 약 1.4kb의 DNA 서열로 운반되는 E.coli 플라스미드를 구성하는 것입니다. 중단점 주변. 두 번째 목표는 DISC1 유전자의 모든 엑손, 프로모터 영역의 1kb, 유전자의 업스트림 및 다운스트림에서 1kb의 시퀀스에 대한 돌연변이 또는 다형성을 스크리닝하기 위한 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC) 방법을 확립하는 것입니다. 중단점.

전좌(1q42.1;11q14.3)-운반 플라스미드 DNA 구성

인간 게놈 DNA 분리 모든 인간 게놈 DNA는 과거에 수집된 이러한 피험자 또는 정보에 입각한 동의가 있는 플라스미드 구축 연구를 위해 특별히 수집된 피험자로부터 사용됩니다. 플라스미드 구축을 위해 Böyum(1968)의 방법을 수정하여 단핵 백혈구를 분리한다. 항응고제로 EDTA가 포함된 전혈은 건강한 지원자의 정맥 천자에 의해 채취됩니다. 수집된 혈액은 동량의 인산완충식염수(PBS)로 희석되고 Histopaque-1077 위에 적층됩니다. 400xg에서 40분 동안 원심분리하여 분리한 후 단핵 백혈구층을 제거하고 세포를 400xg에서 10분 동안 원심분리하여 PBS로 3회 세척합니다. 새로 분리된 세포는 표준 페놀/클로로포름 추출 절차에 따라 게놈 DNA 분리에 추가로 적용될 것입니다(Sambrook et al. 1989).

1q42.1 및 11q14.3의 PCR 증폭 DNA 서열 증폭은 50ul 반응 부피에서 AmpliTaq Gold DNA 중합효소로 수행됩니다. 50ng DNA, 1U 효소, 300ng 각 프라이머, 200mM 각 dNTP, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl 및 10mM Tris-HCl, pH8.3을 포함하는 반응. 모든 반응은 95℃에서 5분의 초기 변성 단계 후 94℃에서 30초 동안 변성 단계, 사용된 프라이머에 적합한 온도에서 1분의 어닐링 단계 및 합성 단계의 35주기로 수행됩니다. 72℃에서 10분간 1q42.1에서 업스트림 중단점의 738bps에 대한 프라이머 서열은 중단점 끝에서 EcoRI 절단 사이트로 설계됩니다. 11q14.3에서 다운스트림 중단점의 719bps에 대한 프라이머 서열도 중단점 끝에서 EcoRI 절단 사이트로 설계됩니다.

2개의 PCR DNA 절편 결찰 및 겔 전기영동에 의한 정제 1q42.1 및 11q14.3의 PCR 산물은 개별적으로 EcoRI와 반응하여 응집력 있는 결찰 부위를 드러냅니다. 각각 약 700bps인 2개의 DNA 단편은 InsT/AcloneTM 클로닝 키트(MBI Fermentas, U.S.A.)에서 제공하는 프로토콜에 따라 T4 DNA 리가제에 의해 결찰됩니다. 결찰된 1.4kb의 DNA 단편은 위의 PCR 절차에 의해 재증폭되고 전기 용출 및 유기 용매로 추출하여 아가로스 겔에서 정제 및 회수됩니다(Sambrook et al. 1989).

분리된 DNA 단편을 E. Coli 플라스미드로 클로닝 정제된 1.4kb의 DNA 단편(0.54pmol 말단)을 플라스미드 벡터 pTZ57R/T DNA(0.165ug, 0.18pmole 말단), 10x 결찰 완충액, PEG 4000 용액 및 T4와 혼합합니다. 리가제 5U. 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 배양한다. InsT/Aclone™ 클로닝 키트에서 제공하는 4ul(168ng, 0.54pmol 말단)의 대조 PCR 단편을 사용하여 대조 라이게이션 반응을 수행합니다.

플라스미드를 Competent E. Coli로 변환 변환은 InsT/Aclone™ 클로닝 키트에서 제공하는 프로토콜을 따릅니다. E.coli 박테리아의 컴피턴트 세포인 DH5α 염색에 냉동된 스톡의 TransformAid C 배지 2ml를 접종하고 37℃ 진탕기에서 밤새 배양합니다. TransformAid C 배지 0.75ml가 들어 있는 예열된 배양 튜브에 밤새 배양한 대장균 0.075ml를 첨가하고 37℃에서 20분 동안 진탕한다.

동일한 부피의 250ul TransformAid T-용액 A와 B를 혼합하여 얼음에 보관합니다. 0.75 ml의 E.coli culture tube를 4℃에서 1분간 회전시킨 후 상등액을 버린다. 300ul의 TransformAid T-용액 혼합물을 첨가하여 E.coli를 얼음 위에서 5분 동안 배양하고 1분 동안 회전시킵니다. 상청액을 버리고 TransformAid T-용액 120ul를 추가하고 얼음에서 5분 더 배양합니다. 결찰 플라스미드 2.5ul(10-20ng) 및 대조군 결찰 혼합물 2ul(10ng 벡터 DNA)를 준비하고 얼음 위에 2분 동안 두었습니다. 얼음에 재현탁된 E.coli 세포 50ul를 각각의 라이게이션 플라스미드에 첨가하고 얼음에서 5분 동안 배양합니다. 라이게이션 플라스미드가 있는 세포를 예열된 LB-Ampicillin 한천 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양합니다. 대조군 라이게이션 플라스미드는 일반적으로 약 90%의 형질전환 효율을 생성합니다.

E.coli 플라스미드의 클론 선택 및 분리 E.coli의 재조합 클론은 lacZ 유전자를 운반하는 벡터가 삽입에 의해 파괴되기 때문에 흰색 선택으로 식별됩니다. 올바른 플라스미드 삽입의 존재는 PCR 반응에 의해 추가로 확인됩니다. 플라스미드는 알칼리 용해 방법(Liou et al., 1999) 또는 상용화된 플라스미드 추출 키트에 의해 대장균으로부터 분리될 것입니다. 단일 세포 콜로니는 30ul의 TE(10mM Tris-HCl, pH7.4; 1mM EDTA, pH8.0) 완충액과 60ul의 SDS-NaOH(1% SDS, 0.1M NaOH)의 혼합물로 픽업되었습니다. 부드럽게 뒤집어 실온에서 5분 동안 배양합니다. 이어서 45ul의 3M 아세트산나트륨 용액(pH5.2)과 130ul의 클로로포름을 세포 혼합물에 첨가하고 5분 동안 미세원심분리합니다. 상부 상을 수집하고 130 ul의 이소프로판올을 첨가하고, 혼합하고 10분 동안 원심분리한다. 플라스미드 DNA 펠릿을 70% 에탄올 100ul로 세척하고 10-20ul의 TE 버퍼에 용해합니다.

모든 환자의 genomic DNA의 breakpoint 영역을 PCR 분리한 플라스미드 DNA와 채취한 정신분열병 환자의 genomic DNA를 염색체 1번과 11번 모두에서 오는 한 쌍의 프라이머로 breakpoint 영역에서 추가 PCR 반응으로 분석합니다. PCR은 AmpliTaq Gold DNA polymerase를 사용하여 50ul 용량으로 수행됩니다. 50ng DNA, 1U 효소, 300ng 각 프라이머, 200mM 각 dNTP, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl 및 10mM Tris-HCl, pH8.3을 포함하는 반응. 모든 반응은 95℃에서 5분의 초기 변성 단계 후 94℃에서 30초 동안 변성 단계, 사용된 프라이머에 적합한 온도에서 1분의 어닐링 단계, 및 합성 단계의 35주기로 수행될 것이다. 72℃에서 10분간 염색체 1q42.1 및 11q14.3의 프라이머 서열이 모두 사용됩니다.

데이터 분석 환자의 약 1.4 kb에 밴드가 있는 PCR 결과는 염색체 1q42.1 영역에 균형 전좌가 있는 것으로 간주됩니다. 발생률은 본 실험에서 분석된 전체 환자 수에 대한 균형 전좌 환자 수를 나누어 계산한다.

예상되는 어려움과 해결책

대만의 어떤 정신분열증 환자에서도 균형 전좌가 발생하지 않은 경우. 다음과 같은 추론이 이루어집니다.

1. 1q42.1 및 11q14.3에서 균형 전좌는 이 실험실에서 수집한 환자에서 발생하지 않았습니다.
2. 인구의 균형이입률은 매우 낮고 거의 0에 가깝습니다.
3. 이 결과는 DISC1 유전자와 정신분열증 사이의 관계 가능성을 배제하지 않을 수 있습니다.
4. 그것은 우리의 이전 실험에서 우리가 이 염색체 영역과 질병 사이에 강한 상관관계를 입증했기 때문에 질병과 관련된 이 영역에 돌연변이나 다형성이 있는지 평가하기 위해 추가 실험을 수행해야 함을 나타냅니다.

DHPLC(Denaturing High Performance Liquid Chromatography) DHPLC는 PCR의 프라이머 및 특정 시약 어레이에 수용되는 완전 자동화된 높은 처리량 분석의 이점을 가진 기술이며 PCR 이외의 샘플 전처리가 필요하지 않습니다(Xiao and Oefner, 2001). 이 기술을 사용하여 DNA 서열의 중단점 영역을 스크리닝하면 정신분열병과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 삽입 및 결실 가능성을 발견하는 속도가 빨라질 것입니다.

상류 및 하류 중단점 영역, 엑손 8 및 엑손 9 DNA 단편을 PCR 수집한 모든 정신분열증 환자의 게놈 DNA를 중단점의 상류 및 하류 1kb, 및 엑손 8 및 엑손 9 덮힌 부분에서 PCR 반응으로 분석합니다. 중단점을 향한 인트론의 DHPLC 분석을 위한 최적의 DNA 조각 길이는 약 500bps이므로 각 PCR 반응에 대해 7쌍의 프라이머가 설계됩니다. PCR은 AmpliTaq Gold DNA polymerase를 사용하여 50ul 용량으로 수행됩니다. 50ng DNA, 1U 효소, 300ng 각 프라이머, 200mM 각 dNTP, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl 및 10mM Tris-HCl, pH8.3을 포함하는 반응. 모든 반응은 95℃에서 5분의 초기 변성 단계 후 94℃에서 30초 동안 변성 단계, 사용된 프라이머에 적합한 온도에서 1분의 어닐링 단계, 및 합성 단계의 35주기로 수행될 것이다. 72℃에서 10분간 PCR 반응 조건은 각 프라이머에서 예측된 Tm에 따라 조정됩니다.

Denaturing HPLC 분석 PCR 과정에서 생성된 순수하고 농축된 PCR 산물을 평가하기 위해 PCR 산물의 DNA 절편을 DHPLC 크로마토그래피로 1차 스크리닝합니다. 돌연변이 및 다형성 분석은 Transgenomic WAVE HPLC(Transgenomic)(Oefner and Underhill, 1998)의 분석 시스템에 대한 방법에 따라 수행됩니다. 500bps 각각의 PCR 산물을 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후 65℃로 냉각시켜 heteroduplex를 형성시킨다. DHPLC는 기술된 바와 같이 DNASep 컬럼(트랜스게노믹)을 사용하여 수행될 것이다(Kuklin et al., 1997). 버퍼 A의 조성은 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA)(트랜스게놈)이고 버퍼 B는 0.1M TEAA, 25% 아세토니트릴을 포함합니다. 분석은 0.9ml/분의 유속 및 4분 동안 분당 2%의 버퍼 B 구배 증가에서 수행됩니다. 버퍼 B의 시작 및 종료 농도는 각 조각에 대해 경험적으로 결정됩니다. 컬럼에서 DNA의 용출은 260 nm에서 흡광도에 의해 감지됩니다. 각 조각에 대한 돌연변이 검출을 위한 최적 온도는 Tm 전 또는 후 약 1-2℃일 것이며 각각의 조각에 대해 경험적으로 결정될 것이다. Wavemaker 소프트웨어를 사용하여 앰플리콘에 존재하는 용융 도메인의 수를 나타내는 경우 HPLC는 해당 온도에서 수행됩니다. Wave Sizing 표준 및 Wave Mutation 표준은 매주 컬럼 분해능과 컬럼 오븐 효율성을 평가합니다.

PCR 단편의 RFLP 및 직접 시퀀싱 DHPLC 크로마토그램의 용출 프로필의 차이를 정신분열증 환자와 대조군 사이에서 비교합니다. 자세한 돌연변이 또는 다형성 서열은 추가 분석을 위해 생명 공학 회사로 보내지거나 특정 돌연변이 또는 다형성을 확인하기 위해 제한 단편 길이 다형성(RFLP)에 의해 보내질 것입니다.

데이터 분석 DHPLC 데이터 분석은 샘플 및 참조 크로마토그램의 주관적 비교를 기반으로 합니다. 현재 제안에서 우리는 대조군과 질병에 걸린 환자를 참조 및 샘플로 사용할 것입니다. 피크 번호는 돌연변이의 존재를 할당하는 가장 중요한 기준이 될 것입니다. 대부분의 경우 대조군 샘플에서 보이는 단일 피크는 돌연변이가 있는 경우 2, 3 또는 4개의 피크를 생성합니다. 피크의 모양은 돌연변이를 식별하는 데 도움이 됩니다. 일부 돌연변이는 단일 피크 모양의 변화로만 볼 수 있습니다.

결과는 DHPLC 크로마토그램의 용출 프로필을 기준으로 점수가 매겨집니다. 다른 프로필은 질병 증상 또는 질병 상태와 상관 관계가 있습니다. 돌연변이 또는 다형성의 일부로서 용출 프로필의 높은 상관관계가 시퀀싱됩니다.

예상되는 어려움과 해결책

1. DHPLC의 돌연변이 결과를 확인하기 위해 이전 작업과의 추가 시퀀싱 및 비교를 사용할 것입니다.
2. 제한 단편 길이 다형성(RFLP)은 특정 돌연변이가 DHPLC에 의해 검출된 경우에도 사용됩니다.

DHPLC는 공동 연구실의 규정에 따라 사용됩니다.