Screening mutací a detekce translokace genu DISC1 u schizofrenie

Návrh grantu má dva hlavní výzkumné cíle. Prvním cílem bude zkonstruovat plasmid E.coli nesený přibližně 1,4 kb sekvencí DNA z každých 700 bps chromozomu 1q42.1 a 11q14.3. kolem bodu zlomu. Druhým cílem bude zavedení metod denaturační vysokoúčinné kapalinové chromatografie (DHPLC) pro screening mutací nebo polymorfismů pro všechny exony genu DISC1, 1 kb v promotorové oblasti a sekvence od 1 kb v upstream a downstream od bod zlomu.

Translokace (1q42.1;11q14.3) - Přenášená Konstrukce plazmidové DNA

Izolace lidské genomové DNA Veškerá lidská genomová DNA bude použita od těchto subjektů odebraných v minulosti nebo subjektů odebraných specificky pro studii konstrukce plazmidu s informovaným souhlasem. Pro konstrukci plazmidu budou mononukleární leukocyty izolovány modifikací metody Böyuma (1968). Plná krev s EDTA jako antikoagulant bude odebrána venepunkcí od zdravých dobrovolníků. Odebraná krev se zředí stejným objemem fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS) a navrství na Histopaque-1077. Po oddělení odstředěním při 400 x g po dobu 40 minut se vrstva mononukleárních leukocytů odstraní a třikrát se promyje PBS odstředěním buněk při 400 x g po dobu 10 minut. Čerstvě izolované buňky budou dále použity pro izolaci genomové DNA podle standardních postupů extrakce fenolem/chloroformem (Sambrook et al. 1989).

PCR amplifikace 1q42.1 a 11q14.3 Sekvence DNA Amplifikace bude provedena pomocí AmpliTaq Gold DNA polymerázy v reakčním objemu 50 ul. Reakce obsahující 50 ng DNA, 1 U enzymu, 300 ng každého primeru, 200 mM každého dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCI a 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Veškerá reakce bude provedena s počátečním denaturačním krokem 5 minut při 95 °C následovaným 35 cykly denaturačního kroku při 94 °C po dobu 30 sekund, krokem nasedání po dobu 1 minuty při teplotě vhodné pro použité primery a krokem syntézy při 72 °C po dobu 10 minut. Sekvence primeru pro 738 bp upstream bodu zlomu na 1q42.1 bude navržena s EcoRI řezným místem na konci bodu zlomu. Sekvence primeru pro 719 bp downstream bodu zlomu v 11q14.3 bude také navržena s EcoRI řezným místem na konci bodu zlomu.

Ligace dvou PCR DNA fragmentů a purifikace gelovou elektroforézou Produkt PCR obou 1q42.1 a 11q14.3 bude reagovat s EcoRI odděleně, aby se odhalila kohezní ligační místa. Dva z fragmentů DNA, každý o velikosti přibližně 700 bps, budou ligovány pomocí T4 DNA ligázy podle protokolu poskytnutého z InsT/AcloneTM klonovací soupravy (MBI Fermentas, U.S.A.). Ligovaný 1,4 kb fragment DNA bude znovu amplifikován výše uvedeným postupem PCR, purifikován a získán z agarózového gelu elektroelucí a extrakcí organickými rozpouštědly (Sambrook et al. 1989).

Klonování izolovaných fragmentů DNA do plazmidu E. coli Purifikovaný fragment DNA o velikosti 1,4 kb (konce 0,54 pmol) bude smíchán s plazmidovým vektorem pTZ57R/T DNA (0,165 ug, konce 0,18 pmol), 10x ligačním pufrem, roztokem PEG 4000 a T4 ligáza 5U. Směs bude inkubována při 22 °C po dobu 1 hodiny. Kontrolní ligační reakce bude provedena s použitím 4 ul (168 ng, 0,54 pmol konce) kontrolního PCR fragmentu poskytnutého klonovací soupravou InsT/AcloneTM.

Transformace plazmidů do kompetentních E. coli Transformace bude probíhat podle protokolu poskytnutého klonovací soupravou InsT/AcloneTM. Kompetentní buňky bakterií E.coli, barvivo DH5α, se naočkují 2 ml média TransformAid C ze zmrazeného zásobního roztoku a kultura se inkubuje přes noc při 37 °C v třepačce. Do předehřáté kultivační zkumavky obsahující TransformAid C médium 0,75 ml se přidá 0,075 ml přes noc kultivované E. coli a třepe se při 37 °C po dobu 20 minut.

Stejné objemy 250 ul TransformAid T-roztoku A a B se smísí a udrží na ledu. 0,75 ml kultivační zkumavky E.coli se odstřeďuje po dobu 1 minuty při 4 °C a supernatant se zlikviduje. Přidáním 300 ul směsi roztoku TransformAid T budou E. coli inkubovány na ledu po dobu 5 minut a odstředěny po dobu 1 minuty. Supernatant se odstraní a přidá se 120 ul roztoku TransformAid T a inkubuje se dalších 5 minut na ledu. Připraví se ligační plazmid 2,5 ul (10-20 ng) a kontrolní ligační směs 2 ul (10 ng vektorová DNA) a ponechá se 2 minuty na ledu. Ke každému ligačnímu plazmidu se přidá 50 ul buněk E. coli resuspendovaných na ledu a inkubuje se na ledu po dobu 5 minut. Buňky s ligačním plazmidem se nanesou na předehřátou LB-ampicilinovou agarovou plotnu a inkubují se přes noc při 37 °C. Kontrolní ligační plazmid obvykle generuje přibližně 90 % účinnosti transformace.

Selekce klonů a izolace plazmidů E. coli Rekombinantní klony E. coli budou identifikovány bílou selekcí, protože vektor nesoucí gen lacZ bude inzercí narušen. Přítomnost správné inzerce plasmidu bude dále potvrzena reakcí PCR. Plazmid bude izolován z E. coli metodou alkalické lýzy (Liou et al., 1999) nebo komerčně dostupným kitem pro extrakci plazmidu. Jedna buněčná kolonie sebrala do směsi s 30 ul TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8,0) pufru a 60 ul SDS-NaOH (1 % SDS, 0,1 M NaOH) budou jemně převráceny a inkubovány po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Následně se do buněčné směsi přidá 45 ul 3M roztoku octanu sodného (pH 5,2) a 130 ul chloroformu a mikrocentrifuguje se 5 minut. Shromáždí se horní fáze a přidá se 130 ul isopropanolu, promíchá se a odstřeďuje se 10 minut. Peleta plasmidové DNA se promyje 70% ethanolem 100 ul a rozpustí v 10-20 ul TE pufru.

PCR oblast zlomu genomové DNA od všech pacientů Izolovaná plazmidová DNA a shromážděná genomová DNA schizofrenních pacientů budou analyzovány další PCR reakcí v oblasti bodu zlomu s párem primerů pocházejících z obou chromozomů 1 a 11. PCR bude provedena v objemu 50 ul s AmpliTaq Gold DNA polymerázou. Reakce obsahující 50 ng DNA, 1 U enzymu, 300 ng každého primeru, 200 mM každého dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCI a 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Veškerá reakce bude provedena s počátečním denaturačním krokem 5 minut při 95 °C následovaným 35 cykly denaturačního kroku při 94 °C po dobu 30 sekund, krokem nasedání po dobu 1 minuty při teplotě vhodné pro použité primery a krokem syntézy při 72 °C po dobu 10 minut. Budou použity sekvence primerů z obou chromozomů 1q42.1 a 11q14.3.

Analýza dat Výsledek PCR s pásem přibližně 1,4 kb pacienta bude považován za mající vyváženou translokaci v oblasti chromozomu 1q42.1. Míra výskytu bude vypočítána vydělením počtu pacientů s vyváženou translokací k celkovému počtu pacientů analyzovaných v tomto experimentu.

Očekávané potíže a řešení

Pokud vyvážená translokace nenastala u žádného schizofrenního pacienta na Tchaj-wanu. Budou provedeny následující závěry:

1. U pacientů odebraných touto laboratoří se nevyskytla žádná vyvážená translokace na 1q42.1 a 11q14.3.
2. Vyrovnaná míra translokace v populaci je poměrně nízká, téměř nulová.
3. Tento výsledek nemusí vyloučit možnost vztahu mezi genem DISC1 a schizofrenií.
4. Znamená to, že je třeba provést další experimenty, aby bylo možné vyhodnotit, zda v této oblasti existují nějaké mutace nebo polymorfismy související s onemocněním, protože v našem předchozím experimentu jsme prokázali silnou korelaci mezi touto oblastí chromozomu a onemocněním.

Denaturační vysoce výkonná kapalinová chromatografie (DHPLC) DHPLC je technika s výhodami plně automatizované vysoce výkonné analýzy, přizpůsobená primerům a specifickým reagenciím PCR a nevyžaduje žádnou jinou předúpravu vzorku než PCR (Xiao a Oefner, 2001). Použití této techniky ke screeningu oblasti zlomu sekvence DNA urychlí zjištění možnosti polymorfismu jednoho nukleotidu nebo inzercí a delecí souvisejících se schizofrenií.

PCR oblast bodu zlomu před a po směru, fragmenty DNA exonu 8 a exonu 9 Všechny odebrané genomové DNA pacientů se schizofrenií budou analyzovány pomocí PCR reakce v upstream a po směru 1 kb od bodu zlomu a části pokryté exonem 8 a exonem 9 intronů směrem k bodu zlomu. Protože optimální délka fragmentu DNA pro analýzu DHPLC je kolem 500 bps, bude pro každou PCR reakci navrženo sedm párů primerů. PCR bude provedena v objemu 50 ul s AmpliTaq Gold DNA polymerázou. Reakce obsahující 50 ng DNA, 1 U enzymu, 300 ng každého primeru, 200 mM každého dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCI a 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Veškerá reakce bude provedena s počátečním denaturačním krokem 5 minut při 95 °C následovaným 35 cykly denaturačního kroku při 94 °C po dobu 30 sekund, krokem nasedání po dobu 1 minuty při teplotě vhodné pro použité primery a krokem syntézy při 72 °C po dobu 10 minut. Podmínky PCR reakce budou upraveny podle Tm predikované z každého primeru.

Denaturační HPLC analýza Fragment DNA produktu PCR bude nejprve podroben screeningu pomocí chromatografu DHPLC, aby se vyhodnotil čistý a koncentrovaný produkt PCR generovaný procesem PCR. Analýza mutací a polymorfismu bude provedena podle metody na analytickém systému od Transgenomic WAVE HPLC (Transgenomic) (Oefner a Underhill, 1998). Produkty PCR každého z 500 bp budou denaturovány při 95 °C po dobu 5 minut a ochlazeny na 65 °C, aby se vytvořily heteroduplexy. DHPLC bude prováděna za použití kolony DNASep (Transgenomic), jak je popsáno (Kuklin et al., 1997). Složení pufru A bude 0,1M triethylamoniumacetát (TEAA) (transgenomický) a pufr B bude obsahovat 0,1M TEAA, 25% acetonitril. Analýza bude prováděna při průtoku 0,9 ml/min a zvýšení gradientu pufru B o 2 % za minutu po dobu 4 minut. Počáteční a koncová koncentrace pufru B se určí empiricky pro každý fragment. Eluce DNA z kolony bude detekována absorbancí při 260 nm. Optimální teplota pro detekci mutace pro každý fragment bude přibližně 1-2 °C před nebo po Tm a bude stanovena empiricky pro každý fragment. Tam, kde bude použit software Wavemaker k indikaci počtu domén tání v amplikonu, bude HPLC prováděna při těchto počtech teplot. Standard Wave Sizing a standard Wave Mutation vyhodnotí rozlišení kolony a účinnost kolonové pece každý týden.

RFLP a přímé sekvenování PCR fragmentů Rozdíly v elučních profilech DHPLC chromatogramů budou porovnány mezi schizofrenními pacienty a kontrolami. Detailní sekvence mutace nebo polymorfismu budou zaslány biotechnologické společnosti k další analýze nebo pomocí polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) k ověření určitých mutací nebo polymorfismů.

Analýza dat Analýza dat DHPLC bude založena na subjektivním srovnání vzorku a referenčního chromatogramu. V tomto návrhu použijeme kontroly a nemocné pacienty jako reference a vzorky. Počet píku bude nejdůležitějším kritériem pro určení přítomnosti mutace. Ve většině případů jediný pík pozorovaný v kontrolním vzorku vytvoří dva, tři nebo čtyři píky v přítomnosti mutace. Tvar píku pomůže identifikovat mutace. Některé mutace budou vnímány pouze jako změny tvaru jednoho píku.

Výsledky budou hodnoceny na základě elučního profilu DHPLC chromatogramu. Různé profily budou korelovat se symptomem onemocnění nebo stavem onemocnění. Bude sekvenována vysoká korelace elučního profilu jako součásti mutace nebo polymorfismů.

Očekávané potíže a řešení

1. K ověření výsledků mutací DHPLC bude použito další sekvenování a srovnání s naší předchozí prací.
2. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) bude také použit, pokud byla pomocí DHPLC detekována specifická mutace.

DHPLC se bude používat podle předpisů ve společné výzkumné kanceláři.