Mutatiescreening en translocatiedetectie van het DISC1-gen bij schizofrenie

Het subsidievoorstel heeft twee belangrijke onderzoeksdoelen. Het eerste doel is het construeren van een E.coli-plasmide met ongeveer 1,4 kb aan DNA-sequenties van elke 700 bps van de chromosoom 1q42.1 en 11q14.3 rond het breekpunt. Het tweede doel is het vaststellen van de denaturerende hogedrukvloeistofchromatografie (DHPLC)-methoden om de mutaties of polymorfismen te screenen voor alle exons van het DISC1-gen, de 1 kb in het promotorgebied en de sequenties van 1 kb stroomopwaarts en stroomafwaarts van het breekpunt.

Translocatie (1q42.1;11q14.3) - gedragen Plasmide-DNA-constructie

Isolatie van menselijk genomisch DNA Al het menselijk genomisch DNA zal worden gebruikt van deze proefpersonen die in het verleden zijn verzameld, of van proefpersonen die specifiek zijn verzameld voor het plasmideconstructieonderzoek met geïnformeerde toestemming. Voor de plasmideconstructie zullen mononucleaire leukocyten geïsoleerd worden door een modificatie van de methode van Böyum (1968). Volbloed met EDTA als antistollingsmiddel zal door middel van aderpunctie worden afgenomen bij gezonde vrijwilligers. Het verzamelde bloed wordt verdund met een gelijk volume fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en aangebracht op Histopaque-1077. Na scheiding door centrifugatie bij 400xg gedurende 40 minuten, wordt de mononucleaire leukocytenlaag verwijderd en driemaal gewassen met PBS door cellen te centrifugeren bij 400xg gedurende 10 minuten. De vers geïsoleerde cellen zullen verder worden toegepast voor genomische DNA-isolatie volgens standaard fenol/chloroform-extractieprocedures (Sambrook et al. 1989).

PCR-amplificatie van 1q42.1 en 11q14.3 DNA-sequenties De amplificatie wordt uitgevoerd met AmpliTaq Gold DNA-polymerase in een reactievolume van 50 µl. De reactie bevat 50 ng DNA, 1 U enzym, 300 ng van elke primer, 200 mM van elke dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl en 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Alle reacties worden uitgevoerd met een initiële denatureringsstap van 5 minuten bij 95 ℃, gevolgd door 35 cycli van een denatureringsstap bij 94 ℃ gedurende 30 seconden, een annealingsstap van 1 minuut bij een temperatuur die geschikt is voor de gebruikte primers en een synthesestap bij 72℃ gedurende 10 min. De primersequentie voor de 738 bps van het stroomopwaartse breekpunt op 1q42.1 zal worden ontworpen met een EcoRI-snijplaats aan het breekpuntuiteinde. De primersequentie voor de 719 bps van het stroomafwaartse breekpunt op 11q14.3 zal ook worden ontworpen met een EcoRI-snijplaats aan het breekpuntuiteinde.

Ligatie van de twee PCR-DNA-fragmenten en zuivering door gelelektroforese Het PCR-product van zowel 1q42.1 als 11q14.3 zal apart met EcoRI worden gereageerd om de cohesieve ligatieplaatsen te onthullen. Twee van de DNA-fragmenten, elk ongeveer 700 bps, zullen worden geligeerd door T4 DNA-ligase volgens het protocol van de InsT/AcloneTM cloning kit (MBI Fermentas, U.S.A.). Het geligeerde DNA-fragment van 1,4 kb zal opnieuw worden geamplificeerd met bovenstaande PCR-procedure, gezuiverd en teruggewonnen uit agarosegel door elektro-elutie en extractie met organische oplosmiddelen (Sambrook et al. 1989).

Klonen van de geïsoleerde DNA-fragmenten in E. Coli-plasmide Het gezuiverde DNA-fragment van 1,4 kb (0,54 pmol uiteinden) wordt gemengd met plasmidevector pTZ57R/T DNA (0,165 ug, 0,18 pmol uiteinden), 10x ligatiebuffer, PEG 4000-oplossing en T4 ligase 5U. Het mengsel wordt gedurende 1 uur bij 22 ℃ geïncubeerd. Er zal een controle-ligatiereactie worden uitgevoerd met behulp van 4 µl (168 ng, 0,54 pmol uiteinden) van het controle-PCR-fragment geleverd door de InsT/AcloneTM-kloneringskit.

Transformatie van de plasmiden in competente E. coli De transformatie zal het protocol van de InsT/AcloneTM cloning kit volgen. Competente cellen van de E.coli-bacterie, DH5α-kleuring, worden geïnoculeerd met 2 ml TransformAid C-medium uit een bevroren bouillon en de kweek wordt een nacht bij 37°C in een schudapparaat geïncubeerd. Een voorverwarmde kweekbuis die TransformAid C-medium 0,75 ml bevat, wordt toegevoegd aan 0,075 ml 's nachts gekweekte E.coli en gedurende 20 minuten bij 37 ℃ geschud.

Gelijke volumes 250 µl TransformAid T-oplossing A en B worden gemengd en op ijs bewaard. De 0,75 ml E.coli-kweekbuis wordt gedurende 1 minuut bij 4°C rondgedraaid en het supernatant wordt weggegooid. Door 300 µl TransformAid T-oplossingmengsel toe te voegen, wordt de E. coli gedurende 5 minuten op ijs geïncubeerd en gedurende 1 minuut gecentrifugeerd. Het supernatant wordt weggegooid en 120 µl TransformAid T-oplossing wordt toegevoegd en nog eens 5 minuten op ijs geïncubeerd. Het ligatieplasmide 2,5 µl (10-20 ng) en het controleligatiemengsel 2 µl (10 ng vector-DNA) worden bereid en gedurende 2 minuten op ijs gezet. De geresuspendeerde op ijs van E. coli-cellen 50 µl zal worden toegevoegd aan elk van de ligatieplasmiden en gedurende 5 minuten op ijs worden geïncubeerd. De cellen met ligatieplasmide worden uitgeplaat op een voorverwarmde LB-Ampicilline-agarplaat en 's nachts geïncubeerd bij 37 ℃. Het controle-ligatieplasmide genereert gewoonlijk ongeveer 90% van de transformatie-efficiëntie.

Kloonselectie en isolatie van de E.coli-plasmiden De recombinante klonen van E.coli zullen worden geïdentificeerd door de witte selectie, omdat de vector die het lacZ-gen draagt, zal worden verstoord door de insertie. De aanwezigheid van correcte plasmide-insertie zal verder worden bevestigd door middel van een PCR-reactie. Het plasmide zal worden geïsoleerd uit E. coli door de methode van alkalische lysis (Liou et al., 1999) of door middel van een in de handel verkrijgbare plasmide-extractiekit. Een eencellige kolonie opgepikt tot een mengsel met 30 ul TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8,0) buffer en 60 ul SDS-NaOH (1% SDS, 0,1 M NaOH) zal voorzichtig worden omgekeerd en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Vervolgens wordt 45 µl 3M natriumacetaatoplossing (pH 5,2) en 130 µl chloroform aan het celmengsel toegevoegd en gedurende 5 minuten gemicrocentrifugeerd. De bovenste fase wordt verzameld en 130 ul isopropanol toegevoegd, gemengd en gedurende 10 minuten gecentrifugeerd. De plasmide-DNA-pellet wordt gewassen met 70% ethanol 100 µl en opgelost in 10-20 µl TE-buffer.

PCR het breekpuntgebied van genomisch DNA van alle patiënten Het geïsoleerde plasmide-DNA en het verzamelde genomisch DNA van schizofrene patiënten zullen worden geanalyseerd door verdere PCR-reactie in het breekpuntgebied met het paar primers afkomstig van zowel chromosoom 1 als 11. PCR zal worden uitgevoerd in een volume van 50 µl met AmpliTaq Gold DNA-polymerase. De reactie bevat 50 ng DNA, 1 U enzym, 300 ng van elke primer, 200 mM van elke dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl en 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Alle reacties worden uitgevoerd met een initiële denaturatiestap van 5 minuten bij 95 ℃, gevolgd door 35 cycli van een denaturatiestap bij 94 ℃ gedurende 30 seconden, een uitgloeistap van 1 minuut bij een temperatuur die geschikt is voor de gebruikte primers en een synthesestap bij 72℃ gedurende 10 min. De primersequenties van zowel chromosoom 1q42.1 als 11q14.3 zullen worden gebruikt.

Gegevensanalyse Het PCR-resultaat met een band op ongeveer 1,4 kb van de patiënt zal worden beschouwd als een gebalanceerde translocatie op het chromosoom 1q42.1-gebied. Het incidentiepercentage zal worden berekend door het aantal patiënten met gebalanceerde translocatie te delen door het totale aantal patiënten dat in dit experiment is geanalyseerd.

Verwachte problemen en oplossingen

Als gebalanceerde translocatie niet heeft plaatsgevonden bij schizofrene patiënten in Taiwan. De volgende gevolgtrekkingen zullen worden gemaakt:

1. Er is geen gebalanceerde translocatie op de 1q42.1 en 11q14.3 opgetreden bij de patiënten die door dit laboratorium zijn verzameld.
2. Het gebalanceerde translocatiepercentage in de bevolking is vrij laag, bijna nul.
3. Dit resultaat sluit de mogelijkheid van een verband tussen het DISC1-gen en schizofrenie niet uit.
4. Het geeft aan dat verdere experimenten moeten worden uitgevoerd om te evalueren of er mutaties of polymorfismen in dit gebied zijn die verband houden met de ziekte, omdat we in ons vorige experiment een sterke correlatie hebben aangetoond tussen dit chromosoomgebied en de ziekte.

Denaturerende hogedrukvloeistofchromatografie (DHPLC) DHPLC is een techniek met voordelen van volledig geautomatiseerde high-throughput-analyse, aangepast aan de primers en de specifieke reagensarrays van PCR, en vereist geen andere voorbehandeling van monsters dan PCR (Xiao en Oefner, 2001). Het gebruik van deze techniek om het breekpuntgebied van de DNA-sequentie te screenen, zal de ontdekking van de mogelijkheid van enkelvoudig nucleotidepolymorfisme of inserties en deleties met betrekking tot de ziekte van schizofrenie versnellen.

PCR het stroomopwaartse en stroomafwaartse breekpuntgebied, exon 8 en exon 9 DNA-fragmenten Al het verzamelde genomische DNA van schizofrene patiënten zal worden geanalyseerd door middel van PCR-reactie op stroomopwaarts en stroomafwaarts 1 kb van het breekpunt, en de met exon 8 en exon 9 bedekte delen van introns naar het breekpunt. Aangezien de optimale DNA-fragmentlengte voor de DHPLC-analyse ongeveer 500 bps is, zullen daarom voor elke PCR-reactie zeven paren primers worden ontworpen. PCR zal worden uitgevoerd in een volume van 50 µl met AmpliTaq Gold DNA-polymerase. De reactie bevat 50 ng DNA, 1 U enzym, 300 ng van elke primer, 200 mM van elke dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl en 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Alle reacties worden uitgevoerd met een initiële denaturatiestap van 5 minuten bij 95 ℃, gevolgd door 35 cycli van een denaturatiestap bij 94 ℃ gedurende 30 seconden, een uitgloeistap van 1 minuut bij een temperatuur die geschikt is voor de gebruikte primers en een synthesestap bij 72℃ gedurende 10 min. PCR-reactieconditie zal worden aangepast volgens de voorspelde Tm van elke primer.

Denaturerende HPLC-analyse Het DNA-fragment van een PCR-product zal eerst worden gescreend door de DHPLC-chromatograaf om een ​​zuiver en geconcentreerd PCR-product te evalueren dat uit het PCR-proces is gegenereerd. Mutatie- en polymorfismeanalyse zal worden uitgevoerd volgens de methode op een analysesysteem van Transgenomic WAVE HPLC (Transgenomic) (Oefner en Underhill, 1998). De PCR-producten van elk van de 500 bps worden gedurende 5 minuten gedenatureerd bij 95°C en afgekoeld tot 65°C voor de vorming van heteroduplexen. DHPLC zal worden uitgevoerd met behulp van een DNASep-kolom (Transgenomic) zoals beschreven (Kuklin et al., 1997). De samenstelling van buffer A zal 0,1 M triethylammoniumacetaat (TEAA) (Transgenomic) zijn en buffer B zal 0,1 M TEAA, 25% acetonitril bevatten. Analyse zal worden uitgevoerd bij een stroomsnelheid van 0,9 ml/min en een verhoging van de buffer B-gradiënt van 2% per minuut gedurende 4 min. Begin- en eindconcentraties van buffer B zullen voor elk fragment empirisch worden bepaald. Elutie van DNA uit de kolom zal worden gedetecteerd door absorptie bij 260 nm. De optimale temperatuur voor mutatiedetectie voor elk fragment zal ongeveer 1-2°C voor of na Tm zijn en zal voor elk fragment empirisch worden bepaald. Waar de Wavemaker-software zal worden gebruikt om aan te geven dat het aantal smeltende domeinen in een amplicon bestond, zal HPLC worden uitgevoerd bij dat aantal temperaturen. Een Wave Sizing-standaard en een Wave Mutation-standaard evalueren wekelijks de kolomresolutie en de efficiëntie van de kolomoven.

RFLP en directe sequencing van PCR-fragmenten Verschillen in de elutieprofielen van DHPLC-chromatogrammen zullen worden vergeleken tussen schizofrene patiënten en controles. De gedetailleerde mutatie- of polymorfismesequenties zullen naar een biotechnologiebedrijf worden gestuurd voor verdere analyse, of door restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP) om bepaalde mutaties of polymorfismen te verifiëren.

Gegevensanalyse DHPLC-gegevensanalyse zal gebaseerd zijn op een subjectieve vergelijking van monster- en referentiechromatogrammen. In het huidige voorstel zullen we controles en zieke patiënten gebruiken als referenties en monsters. Piekgetal zal het belangrijkste criterium zijn voor het toekennen van de aanwezigheid van een mutatie. In de meeste gevallen zal een enkele piek in een controlemonster twee, drie of vier pieken produceren in de aanwezigheid van een mutatie. De vorm van de piek zal helpen om mutaties te identificeren. Sommige mutaties zullen alleen worden gezien als veranderingen in de vorm van een enkele piek.

De resultaten worden gescoord op basis van het elutieprofiel van het DHPLC-chromatogram. Verschillende profielen worden gecorreleerd aan het ziektesymptoom of de ziektestatus. Sterke correlatie van elutieprofiel als onderdeel van mutatie of polymorfismen zal worden gesequenced.

Verwachte problemen en oplossingen

1. Verdere sequentiëring en vergelijking met ons eerdere werk zal worden gebruikt om de mutatieresultaten van DHPLC te verifiëren.
2. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) zal ook worden gebruikt als een specifieke mutatie is gedetecteerd door DHPLC.

De DHPLC zal worden gebruikt volgens de voorschriften in het gemeenschappelijk onderzoeksbureau.