Badania przesiewowe mutacji i wykrywanie translokacji genu DISC1 w schizofrenii

Wniosek o grant ma dwa główne cele badawcze. Pierwszym celem będzie skonstruowanie plazmidu E. coli zawierającego około 1,4 kb sekwencji DNA z każdego 700 bps chromosomu 1q42.1 i 11q14.3 wokół punktu przerwania. Drugim celem będzie opracowanie metod denaturującej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (DHPLC) w celu przeszukiwania mutacji lub polimorfizmów dla wszystkich eksonów genu DISC1, 1 kb w regionie promotora oraz sekwencji od 1 kb w górę i w dół punkt przerwania.

Translokacja (1q42.1;11q14.3)-przenoszona Konstrukcja plazmidowego DNA

Izolacja ludzkiego genomowego DNA Cały ludzki genomowy DNA zostanie wykorzystany od tych osób pobranych w przeszłości lub od osób pobranych specyficznie do badania konstrukcji plazmidu za świadomą zgodą. W celu skonstruowania plazmidu, jednojądrzaste leukocyty zostaną wyizolowane przez modyfikację metody Böyuma (1968). Krew pełna z EDTA jako antykoagulantem zostanie pobrana przez nakłucie żyły od zdrowych ochotników. Pobrana krew zostanie rozcieńczona równą objętością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i nałożona na Histopaque-1077. Po rozdzieleniu przez wirowanie przy 400xg przez 40 min, warstwa jednojądrzastych leukocytów zostanie usunięta i przemyta trzykrotnie PBS przez wirowanie komórek przy 400xg przez 10 min. Świeżo wyizolowane komórki będą dalej stosowane do izolacji genomowego DNA zgodnie ze standardowymi procedurami ekstrakcji fenolem/chloroformem (Sambrook i wsp. 1989).

Amplifikacja PCR 1q42.1 i 11q14.3 Sekwencje DNA Amplifikacja zostanie przeprowadzona przy użyciu polimerazy DNA AmpliTaq Gold w objętości reakcyjnej 50 ul. Mieszanina reakcyjna zawierała 50 ng DNA, 1 U enzymu, 300 ng każdego startera, 200 mM każdego dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Wszystkie reakcje zostaną przeprowadzone z początkowym etapem denaturacji trwającym 5 minut w temperaturze 95 ℃, po którym nastąpi 35 cykli etapu denaturacji w temperaturze 94 ℃ przez 30 sekund, etap hybrydyzacji trwający 1 minutę w temperaturze odpowiedniej dla użytych starterów oraz etap syntezy w 72℃ przez 10 min. Sekwencja startera dla punktu przerwania 738 pz w górę w 1q42.1 zostanie zaprojektowana z miejscem cięcia EcoRI na końcu punktu przerwania. Sekwencja startera dla punktu przerwania 719 pz poniżej punktu przerwania w 11q14.3 zostanie również zaprojektowana z miejscem cięcia EcoRI na końcu punktu przerwania.

Ligowanie dwóch fragmentów DNA PCR i oczyszczanie za pomocą elektroforezy żelowej. Produkt PCR zarówno 1q42.1, jak i 11q14.3 poddaje się oddzielnej reakcji z EcoRI w celu ujawnienia spójnych miejsc ligacji. Dwa fragmenty DNA, każdy o wielkości około 700 pz, zostaną zligowane przez ligazę DNA T4 zgodnie z protokołem dostarczonym z zestawu do klonowania InsT/AcloneTM (MBI Fermentas, USA). Zligowany fragment DNA o długości 1,4 kb zostanie ponownie zamplifikowany za pomocą powyższej procedury PCR, oczyszczony i odzyskany z żelu agarozowego przez elektroelucję i ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi (Sambrook i wsp. 1989).

Klonowanie wyizolowanych fragmentów DNA do plazmidu E. Coli Oczyszczony fragment DNA o długości 1,4 kb (końce 0,54 pmol) miesza się z DNA wektora plazmidowego pTZ57R/T (0,165 μg, końce 0,18 pmol), 10x buforem do ligacji, roztworem PEG 4000 i T4 ligaza 5U. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 22°C przez 1 godzinę. Kontrolna reakcja ligacji zostanie przeprowadzona przy użyciu 4 ul (168 ng, 0,54 pmol końców) kontrolnego fragmentu PCR dostarczonego w zestawie do klonowania InsT/AcloneTM.

Transformacja plazmidów do kompetentnych bakterii E. Coli Transformacja będzie zgodna z protokołem dostarczonym przez zestaw do klonowania InsT/AcloneTM. Komórki kompetentne bakterii E. coli, wybarwione DH5α, zostaną zaszczepione 2 ml pożywki TransformAid C z zamrożonego bulionu i inkubowane przez noc w 37℃ w wytrząsarce. Do wstępnie ogrzanej probówki hodowlanej zawierającej pożywkę TransformAid C 0,75 ml dodać 0,075 ml hodowanej przez noc E.coli i wytrząsać w temperaturze 37°C przez 20 min.

Równe objętości 250 ul TransformAid T-roztwór A i B zostaną zmieszane i przechowywane w lodzie. 0,75 ml probówki do hodowli E. coli będzie wirować przez 1 min w temperaturze 4℃ i odrzucić supernatant. Dodając 300 µl mieszaniny roztworu TransformAid T, E.coli będzie inkubować na lodzie przez 5 minut i wirować przez 1 minutę. Supernatant zostanie odrzucony, a 120 ul roztworu TransformAid T zostanie dodane i inkubowane przez kolejne 5 minut na lodzie. Plazmid ligacyjny 2,5 ul (10-20 ng) i kontrolna mieszanina ligacyjna 2 ul (10 ng DNA wektora) zostaną przygotowane i umieszczone na lodzie przez 2 minuty. Ponownie zawieszone na lodzie komórki E. coli po 50 μl zostaną dodane do każdego plazmidu ligacyjnego i inkubowane na lodzie przez 5 min. Komórki z plazmidem ligacyjnym zostaną wysiane na ogrzaną płytkę z agarem LB-Ampicillin i inkubowane przez noc w temperaturze 37°C. Kontrolny plazmid ligacyjny zwykle generuje około 90% wydajności transformacji.

Selekcja klonów i izolacja plazmidów E. coli Zrekombinowane klony E. coli będą identyfikowane przez białą selekcję, ponieważ wektor niosący gen lacZ zostanie rozerwany przez insercję. Obecność prawidłowej insercji plazmidu zostanie dodatkowo potwierdzona przez reakcję PCR. Plazmid zostanie wyizolowany z E. coli metodą lizy alkalicznej (Liou i in., 1999) lub dostępnym na rynku zestawem do ekstrakcji plazmidu. Pojedyncza kolonia komórek zebrana do mieszaniny z 30 ul buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8,0) i 60 ul SDS-NaOH (1% SDS, 0,1 M NaOH) zostaną delikatnie odwrócone i inkubowane przez 5 min w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny komórek dodaje się kolejne 45 ul 3M roztworu octanu sodu (pH 5,2) i 130 ul chloroformu i mikrowiruje przez 5 min. Górną fazę zbiera się i dodaje 130 ul izopropanolu, miesza i wiruje przez 10 min. Osad plazmidowego DNA przemywa się 70% etanolem 100 ul i rozpuszcza w 10-20 ul buforu TE.

PCR obszar punktu przerwania genomowego DNA wszystkich pacjentów Wyizolowany plazmidowy DNA i zebrany genomowy DNA pacjentów ze schizofrenią będą analizowane przez dalszą reakcję PCR w obszarze punktu przerwania z parą starterów pochodzących z obu chromosomów 1 i 11. PCR zostanie przeprowadzony w objętości 50 ul z użyciem polimerazy AmpliTaq Gold DNA. Mieszanina reakcyjna zawierała 50 ng DNA, 1 U enzymu, 300 ng każdego startera, 200 mM każdego dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Wszystkie reakcje zostaną przeprowadzone z początkowym etapem denaturacji trwającym 5 minut w temperaturze 95 ℃, po którym nastąpi 35 cykli etapu denaturacji w temperaturze 94 ℃ przez 30 sekund, etap hybrydyzacji trwający 1 minutę w temperaturze odpowiedniej dla użytych starterów oraz etap syntezy w 72℃ przez 10 min. Zastosowane zostaną sekwencje starterów z obu chromosomów 1q42.1 i 11q14.3.

Analiza danych Wynik PCR z prążkiem przy około 1,4 kb pacjenta zostanie uznany za wykazujący zrównoważoną translokację w obszarze chromosomu 1q42.1. Częstość występowania zostanie obliczona przez podzielenie liczby pacjentów ze zrównoważoną translokacją przez całkowitą liczbę pacjentów analizowanych w tym eksperymencie.

Spodziewane trudności i rozwiązania

Jeśli translokacja zrównoważona nie wystąpiła u żadnego chorego na schizofrenię na Tajwanie. Zostaną wyciągnięte następujące wnioski:

1. U pacjentów zebranych przez to laboratorium nie wystąpiła zrównoważona translokacja w 1q42.1 i 11q14.3.
2. Współczynnik translokacji zrównoważonej w populacji jest dość niski, bliski zeru.
3. Wynik ten może nie wykluczać możliwości związku między genem DISC1 a schizofrenią.
4. Wskazuje to, że należy przeprowadzić dalsze eksperymenty, aby ocenić, czy jakakolwiek mutacja lub polimorfizm w tym obszarze ma związek z chorobą, ponieważ w naszym poprzednim eksperymencie wykazaliśmy silną korelację między tym obszarem chromosomu a chorobą.

Denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa (DHPLC) DHPLC jest techniką z zaletami w pełni zautomatyzowanej, wysokowydajnej analizy, dostosowanej do starterów i specyficznych zestawów odczynników PCR i nie wymaga wstępnej obróbki próbki innej niż PCR (Xiao i Oefner, 2001). Wykorzystanie tej techniki do przeszukiwania obszaru punktu przerwania sekwencji DNA przyspieszy znalezienie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu lub insercji i delecji związanych z chorobą schizofrenii.

PCR obszar punktu przerwania w górę iw dół, fragmenty DNA eksonu 8 i eksonu 9 Wszystkie zebrane genomowe DNA pacjentów ze schizofrenią zostaną przeanalizowane za pomocą reakcji PCR przy 1 kb w górę iw dół od punktu przerwania, a ekson 8 i egzon 9 pokryte części intronów w kierunku punktu przerwania. Ponieważ optymalna długość fragmentu DNA do analizy DHPLC wynosi około 500 bps, dlatego dla każdej reakcji PCR zostanie zaprojektowanych siedem par starterów. PCR zostanie przeprowadzony w objętości 50 ul z użyciem polimerazy AmpliTaq Gold DNA. Mieszanina reakcyjna zawierała 50 ng DNA, 1 U enzymu, 300 ng każdego startera, 200 mM każdego dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Wszystkie reakcje zostaną przeprowadzone z początkowym etapem denaturacji trwającym 5 minut w temperaturze 95 ℃, po którym nastąpi 35 cykli etapu denaturacji w temperaturze 94 ℃ przez 30 sekund, etap hybrydyzacji trwający 1 minutę w temperaturze odpowiedniej dla użytych starterów oraz etap syntezy w 72℃ przez 10 min. Warunki reakcji PCR zostaną dostosowane zgodnie z przewidywaną Tm dla każdego startera.

Denaturująca analiza HPLC Fragment DNA produktu PCR zostanie najpierw przeszukany przez chromatograf DHPLC w celu oceny czystego i stężonego produktu PCR wytworzonego w procesie PCR. Analiza mutacji i polimorfizmu zostanie przeprowadzona zgodnie z metodą na systemie analizy z Transgenomic WAVE HPLC (Transgenomic) (Oefner i Underhill, 1998). Produkty PCR każdego z 500 pz będą denaturowane w 95°C przez 5 min i schładzane do 65°C w celu utworzenia heterodupleksów. DHPLC zostanie przeprowadzona przy użyciu kolumny DNASep (Transgenomic) zgodnie z opisem (Kuklin i in., 1997). Bufor A będzie składał się z 0,1 M octanu trietyloamonu (TEAA) (transgenomiczny), a bufor B będzie zawierał 0,1 M TEAA, 25% acetonitrylu. Analiza zostanie przeprowadzona przy szybkości przepływu 0,9 ml/min i przy wzroście gradientu buforu B o 2% na minutę przez 4 min. Stężenia początkowe i końcowe buforu B zostaną określone empirycznie dla każdego fragmentu. Elucja DNA z kolumny zostanie wykryta przez absorbancję przy 260 nm. Optymalna temperatura do wykrywania mutacji dla każdego fragmentu będzie wynosić około 1-2℃ przed lub po Tm i zostanie określona empirycznie dla każdego fragmentu. Tam, gdzie oprogramowanie Wavemaker zostanie użyte do wskazania liczby topniejących domen występujących w amplikonie, HPLC zostanie przeprowadzona w tej liczbie temperatur. Standard Wave Sizing i Wave Mutation będą oceniać rozdzielczość kolumny i wydajność pieca kolumny co tydzień.

RFLP i bezpośrednie sekwencjonowanie fragmentów PCR Różnice w profilach elucji chromatogramów DHPLC zostaną porównane między pacjentami ze schizofrenią a grupą kontrolną. Szczegółowe sekwencje mutacji lub polimorfizmów zostaną wysłane do firmy biotechnologicznej w celu dalszej analizy lub za pomocą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) w celu zweryfikowania pewnych mutacji lub polimorfizmów.

Analiza danych Analiza danych DHPLC będzie oparta na subiektywnym porównaniu chromatogramów próbki i odniesienia. W niniejszej propozycji wykorzystamy kontrole i chorych pacjentów jako odniesienia i próbki. Najważniejszym kryterium przypisania obecności mutacji będzie liczba pików. W większości przypadków pojedynczy pik zaobserwowany w próbce kontrolnej da dwa, trzy lub cztery piki w obecności mutacji. Kształt piku pomoże zidentyfikować mutacje. Niektóre mutacje będą widoczne tylko jako zmiany kształtu pojedynczego piku.

Wyniki zostaną ocenione na podstawie profilu elucji chromatogramu DHPLC. Różne profile będą skorelowane z objawem choroby lub stanem chorobowym. Zsekwencjonowana zostanie wysoce skorelowana profil elucji jako część mutacji lub polimorfizmów.

Spodziewane trudności i rozwiązania

1. Dalsze sekwencjonowanie i porównanie z naszą poprzednią pracą zostanie wykorzystane do weryfikacji wyników mutacji DHPLC.
2. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) będzie również zastosowany, jeśli specyficzna mutacja została wykryta przez DHPLC.

DHPLC będzie używany zgodnie z regulaminem wspólnego biura badawczego.