Mutationsscreening och translokationsdetektion av DISC1-gen vid schizofreni

Bidragsförslaget har två stora forskningsmål. Det första målet kommer att vara att konstruera en E.coli-plasmid som bärs med cirka 1,4 kb DNA-sekvenser från varje 700 bps av kromosomen 1q42.1 och 11q14.3 runt brytpunkten. Det andra målet är att etablera metoderna för denaturerande högpresterande vätskekromatografi (DHPLC) för att screena mutationerna eller polymorfismerna för alla exoner av DISC1-genen, 1 kb vid promotorregionen och sekvenserna från 1 kb uppströms och nedströms om brytpunkten.

Translokation (1q42.1;11q14.3)-Bären Plasmid-DNA-konstruktion

Isolering av humant genomiskt DNA Allt humant genomiskt DNA kommer att användas från dessa försökspersoner som samlats in tidigare, eller ämnen som samlats in specifikt för plasmidkonstruktionsstudien med informerat samtycke. För plasmidkonstruktionen kommer mononukleära leukocyter att isoleras genom en modifiering av metoden enligt Böyum (1968). Helblod med EDTA som antikoagulant kommer att tas genom venpunktion från friska frivilliga. Det uppsamlade blodet kommer att spädas ut med en lika stor volym fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skiktas på Histopaque-1077. Efter separation genom centrifugering vid 400xg under 40 minuter, kommer det mononukleära leukocytskiktet att avlägsnas och tvättas tre gånger med PBS genom att centrifugera celler vid 400xg under 10 minuter. De nyligen isolerade cellerna kommer att användas ytterligare för genomisk DNA-isolering enligt vanliga fenol/kloroformextraktionsförfaranden (Sambrook et al. 1989).

PCR-amplifiering av 1q42.1 och 11q14.3 DNA-sekvenser Amplifieringen kommer att utföras med AmpliTaq Gold DNA-polymeras i en 50 ul reaktionsvolym. Reaktionen innehöll 50 ng DNA, 1 U enzym, 300 ng av varje primer, 200 mM av varje dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl och 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. All reaktion kommer att utföras med ett initialt denatureringssteg på 5 minuter vid 95 ℃ följt av 35 cykler av ett denatureringssteg vid 94 ℃ under 30 sekunder, ett annealingssteg på 1 min vid en temperatur som är lämplig för de använda primrarna och ett syntessteg vid 72 ℃ i 10 min. Primersekvensen för 738 bps uppströms brytpunkt vid 1q42.1 kommer att utformas med ett EcoRI-skärställe vid brytpunktsänden. Primersekvensen för de 719 bps av nedströms brytpunkten vid 11q14.3 kommer också att utformas med ett EcoRI-skärställe vid brytpunktsänden.

Ligering av de två PCR-DNA-fragmenten och rening med gelelektrofores PCR-produkten från både 1q42.1 och 11q14.3 kommer att reageras med EcoRI separat för att avslöja de kohesiva ligeringsställena. Två av DNA-fragmenten, cirka 700 bps vardera, kommer att ligeras av T4 DNA-ligas enligt protokollet som tillhandahålls från InsT/AcloneTM-kloningskit (MBI Fermentas, U.S.A.). Det ligerade 1,4 kb DNA-fragmentet kommer att återamplifieras med ovanstående PCR-förfarande, renas och utvinnas från agarosgel genom elektroeluering och extraktion med organiska lösningsmedel (Sambrook et al. 1989).

Kloning av de isolerade DNA-fragmenten i E. Coli-plasmid Det renade 1,4 kb DNA-fragmentet (0,54 pmol-ändar) kommer att blandas med plasmidvektorn pTZ57R/T-DNA (0,165 ug, 0,18 pmol-ändar), 10x ligeringsbuffert, PEG 4000-lösning och T4000-lösning ligas 5U. Blandningen kommer att inkuberas vid 22 ℃ i 1 timme. En kontrollligeringsreaktion kommer att utföras med användning av 4 ul (168 ng, 0,54 pmol ändar) av kontroll-PCR-fragment som tillhandahålls av InsT/AcloneTM-kloningskit.

Transformation av plasmiderna till kompetent E. Coli Transformationen kommer att följa protokollet som tillhandahålls av InsT/AcloneTM-kloningssatsen. Kompetenta celler av E.coli-bakterier, DH5α-färgning, kommer att inokuleras med 2 ml TransformAid C-medium från en frusen stam och inkubera kulturen över natten vid 37 ℃ i en shaker. Ett förvarmt odlingsrör innehållande TransformAid C-medium 0,75 ml kommer att tillsättas med 0,075 ml över natten odlad E.coli och skakas vid 37 ℃ i 20 minuter.

Lika volymer 250 ul TransformAid T-lösning A och B kommer att blandas och förvaras på is. 0,75 ml E.coli-odlingsrör kommer att centrifugeras i 1 min vid 4 ℃ och kasseras supernatanten. Tillsätter 300 ul av TransformAid T-lösningsblandning, kommer E.coli att inkuberas på is i 5 min och centrifugeras i 1 min. Supernatanten kommer att kasseras och 120 ul TransformAid T-lösning tillsätts och inkuberas i ytterligare 5 minuter på is. Ligeringsplasmiden 2,5 ul (10-20 ng) och kontrollligeringsblandningen 2 ul (10 ng vektor-DNA) kommer att beredas och stå på is i 2 minuter. De återsuspenderade på is av E.coli-celler 50 ul kommer att tillsättas till var och en av ligeringsplasmiderna och inkuberas på is under 5 min. Cellerna med ligeringsplasmid kommer att strykas ut på en förvärmd LB-Ampicillin-agarplatta och inkuberas över natten vid 37 ℃. Kontrollligeringsplasmiden genererar vanligtvis omkring 90 % av transformationseffektiviteten.

Klonselektion och isolering av E.coli-plasmiderna De rekombinanta klonerna av E.coli kommer att identifieras av den vita selektionen, eftersom vektorn som bar lacZ-genen kommer att störas av insättningen. Närvaron av korrekt plasmidinsättning kommer att bekräftas ytterligare genom PCR-reaktion. Plasmiden kommer att isoleras från E. coli genom metoden för alkalisk lys (Liou et al., 1999) eller genom kommersialiserat plasmidextraktionskit. En enkelcellskoloni togs upp till en blandning med 30 ul TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8,0) buffert och 60 ul SDS-NaOH (1 % SDS, 0,1 M NaOH) kommer att vändas försiktigt och inkuberas i 5 minuter vid rumstemperatur. Därefter tillsätts 45 ul 3M natriumacetatlösning (pH 5,2) och 130 ul kloroform till cellblandningen och mikrocentrifugeras i 5 minuter. Den övre fasen samlas upp och tillsätts 130 ul isopropanol, blandas och centrifugeras i 10 minuter. Plasmid-DNA-pelleten kommer att tvättas med 70 % etanol 100 ul och lösas i 10-20 ul TE-buffert.

PCR brytpunktsområdet för genomiskt DNA från alla patienter Det isolerade plasmid-DNA och de samlade schizofrena patienternas genomiska DNA kommer att analyseras genom ytterligare PCR-reaktion i brytpunktsområdet med primerparet som kommer från både kromosom 1 och 11. PCR kommer att utföras i en volym av 50 ul med AmpliTaq Gold DNA-polymeras. Reaktionen innehöll 50 ng DNA, 1 U enzym, 300 ng av varje primer, 200 mM av varje dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl och 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. All reaktion kommer att utföras med ett initialt denatureringssteg på 5 minuter vid 95 ℃ följt av 35 cykler av ett denatureringssteg vid 94 ℃ under 30 sekunder, ett hybridiseringssteg på 1 min vid en temperatur som är lämplig för de använda primrarna och ett syntessteg vid 72 ℃ i 10 min. Primersekvenserna från både kromosom 1q42.1 och 11q14.3 kommer att användas.

Dataanalys PCR-resultat med ett band på cirka 1,4 kb av patienten kommer att anses ha en balanserad translokation vid kromosom 1q42.1-området. Incidensfrekvensen kommer att beräknas genom att dividera antalet patienter med balanserad translokation med det totala antalet patienter som analyserats i detta experiment.

Förväntade svårigheter och lösningar

Om balanserad translokation inte skedde hos några schizofrena patienter i Taiwan. Följande slutsatser kommer att göras:

1. Ingen balanserad translokation vid 1q42.1 och 11q14.3 har inträffat hos patienter som samlats in av detta laboratorium.
2. Den balanserade translokationshastigheten i befolkningen är ganska låg, nästan noll.
3. Detta resultat kanske inte utesluter möjligheten av ett samband mellan DISC1-genen och schizofreni.
4. Det indikerar att ytterligare experiment måste utföras för att utvärdera om någon mutation eller polymorfismer i detta område relaterar till sjukdomen, eftersom vi i vårt tidigare experiment har visat en stark korrelation mellan detta kromosomområde och sjukdomen.

Denaturerande högpresterande vätskekromatografi (DHPLC) DHPLC är en teknik med fördelarna med helautomatisk högkapacitetsanalys, anpassad till primrarna och de specifika reagensuppsättningarna av PCR, och krävde ingen provförbehandling annat än PCR (Xiao och Oefner, 2001). Att använda denna teknik för att screena brytpunktsområdet för DNA-sekvensen kommer att påskynda upptäckten av möjligheten att ha singelnukleotidpolymorfism eller insättningar och deletioner relaterade till schizofrenisjukdom.

PCR uppströms och nedströms brytpunktsområdet, exon 8 och exon 9 DNA-fragment Alla insamlade schizofrena patienters genomiska DNA kommer att analyseras genom PCR-reaktion vid uppströms och nedströms 1 kb om brytpunkten, och exon 8 och exon 9 täckta delar av introner mot brytpunkten. Eftersom den optimala DNA-fragmentlängden för DHPLC-analysen är cirka 500 bps, kommer därför sju par primrar att utformas för varje PCR-reaktion. PCR kommer att utföras i en volym av 50 ul med AmpliTaq Gold DNA-polymeras. Reaktionen innehöll 50 ng DNA, 1 U enzym, 300 ng av varje primer, 200 mM av varje dNTP, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl och 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. All reaktion kommer att utföras med ett initialt denatureringssteg på 5 minuter vid 95 ℃ följt av 35 cykler av ett denatureringssteg vid 94 ℃ under 30 sekunder, ett hybridiseringssteg på 1 min vid en temperatur som är lämplig för de använda primrarna och ett syntessteg vid 72 ℃ i 10 min. PCR-reaktionsförhållandena kommer att justeras enligt Tm som förutsägs från varje primer.

Denaturerande HPLC-analys DNA-fragmentet av en PCR-produkt kommer först att screenas med DHPLC-kromatografen för att utvärdera en ren och koncentrerad PCR-produkt genererad från PCR-processen. Mutations- och polymorfismanalys kommer att utföras enligt metoden på ett analyssystem från Transgenomic WAVE HPLC (Transgenomic) (Oefner och Underhill, 1998). PCR-produkterna för var och en av de 500 bps kommer att denatureras vid 95°C under 5 minuter och kylas till 65°C för bildning av heteroduplex. DHPLC kommer att utföras med användning av en DNASep-kolonn (Transgenomic) såsom beskrivits (Kuklin et al., 1997). Sammansättningen av buffert A kommer att vara 0,1 M trietylammoniumacetat (TEAA) (Transgenomic), och buffert B kommer att innehålla 0,1 M TEAA, 25 % acetonitril. Analys kommer att utföras med en flödeshastighet på 0,9 ml/min och en buffert B-gradientökning på 2 % per min under 4 min. Start- och slutkoncentrationer av buffert B kommer att bestämmas empiriskt för varje fragment. Eluering av DNA från kolonnen kommer att detekteras genom absorbans vid 260 nm. Den optimala temperaturen för mutationsdetektion för varje fragment kommer att vara ungefär 1-2 ℃ före eller efter Tm och kommer att bestämmas empiriskt för varje fragment. Där Wavemaker-mjukvaran kommer att användas för att indikera att antalet smältdomäner fanns i en amplikon, kommer HPLC att utföras vid detta antal temperaturer. En vågstorleksstandard och en vågmutationsstandard kommer att utvärdera kolumnupplösningen och kolumnugnseffektiviteten varje vecka.

RFLP och direkt sekvensering av PCR-fragment Skillnader i elueringsprofilerna för DHPLC-kromatogram kommer att jämföras mellan schizofrena patienter och kontroller. Detaljmutations- eller polymorfismsekvenserna kommer att skickas ut till bioteknikföretaget för vidare analys, eller genom restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP) för att verifiera vissa mutationer eller polymorfismer.

Dataanalys DHPLC-dataanalys kommer att baseras på en subjektiv jämförelse av prov- och referenskromatogram. I föreliggande förslag kommer vi att använda kontroller och sjuka patienter som referenser och prover. Toppnummer kommer att vara det viktigaste kriteriet för att tilldela närvaron av en mutation. I de flesta fall kommer en enda topp som ses i ett kontrollprov att producera två, tre eller fyra toppar i närvaro av en mutation. Formen på toppen hjälper till att identifiera mutationer. Vissa mutationer kommer endast att ses som förändringar i formen av en enda topp.

Resultaten kommer att bedömas baserat på elueringsprofilen för DHPLC-kromatogrammet. Olika profiler kommer att vara korrelerade till sjukdomssymptom eller sjukdomsstatus. Hög korrelation av elueringsprofil som del av mutation eller polymorfismer kommer att sekvenseras.

Förväntade svårigheter och lösningar

1. Ytterligare sekvensering och jämförelse med vårt tidigare arbete kommer att användas för att verifiera mutationsresultaten av DHPLC.
2. Restriktionsfragmentlängdpolymorfism (RFLP) kommer också att användas om en specifik mutation har detekterats med DHPLC.

DHPLC kommer att användas enligt bestämmelserna i det gemensamma forskningskontoret.