난소 신생물의 혈관에서 바소프레신의 평가

디. 현황: 배경 및 의의/예비 연구

신혈관형성은 암 성장의 절대적인 초기 사건입니다. 결과적으로, 혈관신생은 일반적으로 대부분의 악성 종양 및 특히 부인과 악성 종양의 질병 진행 및 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 보입니다. 난소암은 두 번째로 흔한 부인과 악성종양이며, 부인과 악성종양 중에서 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 2003년에 미국에서 23,300명의 새로운 난소암 사례가 진단되고 13,900명의 여성이 질병으로 사망할 것으로 추정됩니다. 혈관신생은 난소암의 예후 지표로 작용할 수 있습니다. 암에서 혈관신생은 안지오게닌, 내피 세포 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함하는 다양한 사이토카인에 대한 반응으로 내피 세포의 증식 및 이동을 필요로 합니다. 이러한 사이토카인 중 일부의 발현은 부인과 악성 종양에서 평가되었습니다. 면역조직화학에 의한 VEGF 단백질의 증가된 발현은 초기 상피성 난소암에서 18개월 대 120개월의 무병 생존 감소와 관련이 있습니다. 반대로 항혈관신생 인자에 대한 노출은 시험관 내에서 종양 세포 성장을 억제해야 합니다. 안지오스타틴과 엔도스타틴은 또한 쥐의 난소암 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌습니다 7.

일반적으로 빠르게 성장하는 악성종양, 특히 난소암에 필요한 혈관신생은 벽에 평활근이 적은 많은 새로운 혈관을 포함해야 합니다. 혈관 평활근의 양적 감소로 인해 이러한 혈관은 또한 양성 종양에서 발견되는 혈관보다 혈류에 대한 저항이 감소합니다. 혈관 저항이 낮은 악성 종양은 미세혈관 밀도(MVD)의 차이 없이 감소된 평활근 액틴 발현 및 강렬한 Cd34 발현을 나타내는 것으로 나타났습니다. 8. 평활근 액틴(SMA) 및 CD34(내피 세포 마커)는 양성 종양에서 관찰되는 것과 비교하여 악성 난소 종양 내 혈관의 낮은 혈류 저항이 종양 혈관의 잘 발달되지 않은 근육 외피와 연관될 수 있음을 입증했습니다. Color-flow Doppler 영상은 양성 종양과 악성 종양을 구별하기 위한 마커로 변경된 혈류 패턴을 사용합니다. 9. 연구자들은 Color-flow Doppler 초음파를 통해 난소 신생물에서 종양 내 혈관 형성의 존재를 평가했습니다. 양성 종양 및 낭종은 박동 지수(PI)가 상당히 높습니다(평균, 1.93 +/- 1.02; 범위, 0.23-3.99). 및 저항 지수(RI)(평균, 0.77 +/- 0.22; 범위, 0.2-1.0) 악성 종양보다(PI: 평균, 0.77 +/- 0.33; 범위, 0.31-1.09; RI: 평균, 0.5 +/- 0.17; 범위, 0.27-0.67). 그러나 일부 중첩은 양성 및 악성 병변에 대한 개별 값에 존재합니다. 따라서 종양내 혈류를 나타내는 양성 및 악성 난소 종양의 혈관신생 및 혈관 저항성 성질의 차이는 MVD가 아닌 종양 혈관의 내피 세포 활성과 상관관계가 있을 수 있습니다. 종양 혈관 내의 혈류에 대한 이러한 낮은 저항 및 후속 내피 세포 활동은 국소, 내피 세포 또는 혈관 평활근 세포, 아르기닌-바소프레신(AVP) 합성 및 바소프레신 ​​수용체에 대한 후속 작용과 함께 방출에 의해 조절될 수 있습니다.

아르기닌-바소프레신(AVP)은 시상하부에서 합성되고 뇌하수체 후엽에서 분비되는 것으로 고전적으로 알려진 펩티드 호르몬입니다. AVP는 신체에서 다양한 역할을 하며 혈관 수축, 포도당신생합성, 코르티코스테로이드 생성, 물과 요소의 배설을 포함하는 다양한 전신 생리학적 기능을 가지고 있습니다. AVP는 주로 V1 수용체에 의해 매개되는 것으로 생각되는 말초 혈관 수축을 유발합니다. AVP는 칼슘 스파이크 활성을 증가시키는 포스포리파제 A2의 자극과 함께 V1a 수용체의 활성화를 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 이를 수행하는 것으로 생각됩니다. AVP는 또한 신체의 다른 고혈압 인자와 단백질의 발현을 조절함으로써 이를 수행할 수 있습니다. AVP는 쥐의 대동맥 수축 후 고혈압 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 쥐에게 복부 대동맥 수축 후 AVP를 투여했을 때 고혈압이 발생했고 이 동물은 안지오텐신 II에 대한 반응이 증가했습니다. 따라서 AVP는 안지오텐신 II와 같은 다른 인자의 발현을 허용하는 것으로 생각됩니다. AVP의 존재는 자발성 고혈압 쥐 및 DOCA 염 고혈압과 같은 고혈압의 다른 동물 모델에서 중요합니다. 예를 들어, 유전적으로 시상하부에서 바소프레신을 합성할 수 없는 Brattleboro 쥐에게 DOCA 염을 투여하면 고혈압이 발생하지 않습니다. 그러나 외인성 AVP를 투여하면 DOCA 염 치료를 받았을 때 이러한 쥐에게 고혈압이 발생합니다.

AVP에 대한 혈관 평활근 세포의 노출은 또한 세 가지 MAP 키나제 계열 경로의 활성화를 통해 평활근 액틴을 증가시킵니다. AVP는 평활근 액틴을 조절하고 증가시키는 능력이 있기 때문에 이것은 AVP가 혈관 평활근의 성장을 조절할 뿐만 아니라 평활근 특이적 수축성 단백질의 발현을 촉진할 수 있음을 시사합니다. 이전 연구에서는 AVP가 정상 혈압 쥐에 비해 젊은 자발성 고혈압 쥐(SHR)에서 과장된 혈관 수축을 생성할 수 있음을 보여주었습니다. 이 과장된 반응은 증가된 AVP 유전자 발현과 관련된 V1 수용체의 밀도가 더 높은 것과 관련이 있는 것 같습니다. 마지막으로 AVP 및 기타 신경펩티드는 일부 고형 종양에 대한 자가분비 성장 인자 역할을 하는 것으로 나타났습니다. AVP의 분열 촉진 영향은 세포내 칼슘의 증가와 관련이 있는 것으로 생각됩니다. AVP는 종종 소세포 폐암(SCLC)에서 발현되며 이러한 암에서 자가분비 성장 인자로 작용할 수 있습니다. SCLC에서 AVP 발현은 정상적인 억제 활성의 조절에 의존하는 것으로 생각됩니다 12. AVP는 혈관 수축 및 평균 혈관압의 생리학에 연루되어 있고 또한 특정 유형의 암에서 발현되는 것으로 나타났기 때문에 난소암 발암에서 종양내 혈관신생에서 혈관신생 인자로서의 역할을 할 수도 있습니다. 우리가 제안한 연구의 목적은 AVP 발현과 그 혈관 수용체와 난소 신생물 조직학 사이의 관계를 조사하는 것입니다.

예비 결과:

최근에 우리 실험실은 VP mRNA 및 V1 수용체 mRNA 분석을 위해 인간 장간막 동맥을 분리하고 분석했습니다. V1R mRNA는 확장기 혈압과 강한 양의 상관관계를 보였다(r = 0.70, p = 0.0112). V1R mRNA는 암컷보다 수컷에서 더 큰 경향이 있었습니다(V1R mRNA의 2.3 + 0.94 상대 발현 단위에 비해 5.73 + 1.29, p = 0.057). 또한 동맥 AVP mRNA는 연령과 음의 상관관계를 보였다(p=0.0028). 이러한 결과는 VP 및 V1R 발현의 변화가 난소암과 같은 질병 상태에 관여할 수 있음을 시사하며, 여기서 혈압 및 혈액 흐름은 물론 나이가 종양의 악성 종양 발달에 요인이 될 수 있습니다.

AVP 펩타이드는 다른 혈관에서 방사면역측정법으로 측정되었습니다. 요골 및 유방 동맥 및 복재 정맥 샘플 및 면역 활성은 HPLC 분석에서 합성 AVP와 함께 이동하는 것으로 나타났습니다. 호르몬 수치는 감지할 수 없는 수준에서 60 uU/gr 조직에 이르기까지 다양했습니다. 따라서 채취한 난소종양 혈관에서 AVP 단백질을 직접 측정하여 VP 유전자 발현의 변화도 확인할 수 있을 것이다.

6. 계획: 난소를 제거하는 18세 이상의 여성이 프로토콜에 등록됩니다. 총 110개의 표본을 얻을 것입니다. 우리 기관에서는 매년 약 200명의 환자가 난소를 제거합니다. 양성(비암성) 또는 악성(암성) 징후로 인해 부인과 조직을 제거한 모든 환자는 포함 기준을 충족합니다. 원발성 부인과 악성 종양이 아닌 악성 종양이 있는 환자는 연구에서 제외됩니다. 각 환자의 종양 내 혈관성은 도플러 초음파로 평가하고 전신 혈압은 수술 전에 측정합니다.

조직 표본의 조달, 준비 및 배송 절차 난소 동맥 및 정맥 표본은 AVP 펩타이드 분석과 AVP 및 바소프레신 ​​수용체 mRNA에 대해 수집됩니다. 수술실 직원은 조직, 난소 동맥 및 정맥 세그먼트를 신선하게 유지하고 고정액에 넣지 않도록 요청받습니다. 조직을 제거한 후 즉시 검체를 다음과 같이 준비합니다. 가장 살균된 1차 조직을 최소 5.0cm 길이로 절단합니다. 그런 다음 종양 조직은 가능한 한 많은 결합 조직에서 분리됩니다. 표본은 RNA 보존제인 RNAlaterTM에 담겨 젖은 얼음 위에 놓여져 신속하게 임상 조사 연구소로 보내질 것입니다. AVP 펩티드의 실험실 분석 및 AVP 및 바소프레신 ​​수용체 mRNA 분리 및 정량화는 임상 조사부의 생리학 및 연구 약리학 실험실에서 수행될 것입니다.

실험실 방법: 바소프레신 ​​합성(VP mRNA로 표시) 및 바소프레신 ​​수용체(V1R 또는 V2R) 상향 또는 하향 조절(V1R mRNA 또는 V2R mRNA 수준으로 표시)을 평가합니다. V1R mRNA에 추가하여 V2R을 측정하면 난소 신생물에서 V1R 발현의 가능한 변화가 해당 수용체 하위 유형에 특이적인지 여부를 명확히 하는 데 도움이 됩니다. 난소 동맥 샘플을 분리하여 상업적 키트(Invitrogen Carlsbad, CA)로 RNA를 추출할 때까지 -70oC에서 RNA later TM(Ambion, Austin, TX)에 보관합니다. VP mRNA, V1R mRNA 및 베타 액틴 mRNA는 iCycler(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 정량적 실시간 PCR(qPCR)로 정량화됩니다. RNA에서 cDNA로의 역전사는 Superscript TM(Invitrogen)을 사용하여 수행되며 PCR은 Platinum qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen)로 수행됩니다. 표준 곡선은 인간 혈관 cDNA 스톡의 희석액을 사용하여 생성되며 각 샘플의 주기 임계값은 희석액의 할당된 복제 수와 관련됩니다. qPCR 데이터는 베타-액틴 mRNA 카피당 VP, V1R 또는 V2R mRNA 카피의 비율로 표현됩니다. 우리가 측정하고 있는 세 가지 mRNA 세그먼트 모두에서 생성물 생성, 약 3.3의 수율 기울기는 온도에서 각 주기마다 생성물의 배가 거의 100% 효율을 나타내며, 겔 전기영동은 생성물의 한 밴드를 나타냅니다. 모든 정량은 각 제품에 대한 특정 형광 프로브의 증가하는 강도 감지를 통해 수행됩니다.

바소프레신 ​​펩타이드는 혈관 조직 추출물의 방사면역측정법으로 분석됩니다. 먼저 혈액이 없는 조직을 0.1N 아세트산으로 헹구고 조직을 닦아내고 무게를 측정하여 조직을 추출합니다. 표본을 차가운 1.0N HCl(1ml/0.5g 조직)에 넣고 Polytron으로 1분 동안 균질화합니다. 균질액은 45분 동안 27,000G에서 원심분리됩니다. 상청액을 저장하고 펠릿을 1ml 1.0N HCl에 재현탁 및 재균질화하고 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 합합니다. 그런 다음 옥타데실실란 카트리지(SepPak, C-18, Waters, Milford, MA)에 흡착시켜 혈장 샘플로 일상적으로 수행하는 것처럼 상청액을 추출하고 산성화된 에탄올로 용출합니다. 용출액을 진공으로 건조하고 분석 완충액에 현탁합니다. 이 시점에서 샘플을 C-18 HPLC 컬럼에 적용하고 39% MeOH의 0.05M NH4AC와 각 1ml 분획으로 구성된 단일상 완충액 시스템에서 용리하고 진공에서 건조하고 방사면역분석 완충액에 현탁하고 분석할 수 있습니다. . 또는 초기 샘플에 간섭이 없다는 초기 확인 후에 HPLC 분류를 수행할 필요가 없을 수도 있습니다. 이 경우, 초기 추출물은 방사면역측정법으로 직접 분석됩니다.