Avaliação da Vasopressina nos Vasos das Neoplasias Ovarianas

d. STATUS: Antecedentes e Significado/Estudos Preliminares

A neovascularização é um evento precoce obrigatório no crescimento do câncer. Consequentemente, a angiogênese parece desempenhar um papel importante na progressão da doença e na sobrevivência da maioria das malignidades em geral e especificamente das malignidades ginecológicas. O câncer de ovário é a segunda neoplasia ginecológica mais comum e a principal causa de morte relacionada ao câncer entre as neoplasias ginecológicas. Estima-se que 23.300 novos casos de câncer de ovário serão diagnosticados nos Estados Unidos em 2003 e que 13.900 mulheres morrerão da doença. A angiogênese pode servir como um indicador prognóstico no câncer de ovário. A angiogênese no câncer requer a proliferação e migração de células endoteliais em resposta a uma variedade de citocinas para incluir angiogenina, fator de crescimento de células endoteliais e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). A expressão de algumas dessas citocinas foi avaliada em neoplasias ginecológicas. O aumento da expressão da proteína VEGF por imuno-histoquímica foi associado à diminuição da sobrevida livre de doença 18 versus 120 meses em cânceres ovarianos epiteliais em estágio inicial. Por outro lado, qualquer exposição a fatores antiangiogênicos deve inibir o crescimento de células tumorais in vitro. A angiostatina e a endostatina também demonstraram inibir o crescimento do câncer de ovário em camundongos 7.

A neovascularização necessária para malignidades de crescimento rápido em geral, e câncer de ovário especificamente, exige que elas contenham muitos vasos novos que tenham menos músculo liso em suas paredes. Devido à diminuição quantitativa no músculo liso vascular, esses vasos também têm uma resistência menor ao fluxo sanguíneo do que os vasos encontrados em tumores benignos. Demonstrou-se que tumores malignos com baixa resistência vascular demonstram expressão diminuída de actina de músculo liso e expressão intensa de Cd34 sem diferenças na densidade de microvasos (MVD) observadas 8. Análise imuno-histoquímica usando anticorpos monoclonais contra actina de músculo liso (SMA) e CD34 (uma célula endotelial marcador) demonstraram que a baixa resistência ao fluxo sanguíneo em vasos dentro de tumores ovarianos malignos pode estar associada a um revestimento muscular pouco desenvolvido nos vasos tumorais, em comparação com o observado em tumores benignos. A imagem com Doppler colorido usa os padrões alterados do fluxo sanguíneo como um marcador na tentativa de diferenciar tumores benignos de malignos 9. Pesquisadores avaliaram a presença de vascularização intratumoral em neoplasias ovarianas por ultrassom Doppler colorido. Tumores e cistos benignos têm um índice de pulsatilidade (PI) significativamente maior (média, 1,93 +/- 1,02; intervalo, 0,23-3,99) e índice resistivo (RI) (média, 0,77 +/- 0,22; intervalo, 0,2-1,0) do que os tumores malignos (PI: média, 0,77 +/- 0,33; intervalo, 0,31-1,09; IR: média, 0,5 +/- 0,17; intervalo, 0,27-0,67). Alguma sobreposição, no entanto, existe em valores individuais para lesões benignas e malignas. A diferença nas naturezas angiogênica e resistente vascular de tumores ovarianos benignos e malignos que apresentam fluxo sanguíneo intratumoral pode, portanto, ser correlacionada com a atividade das células endoteliais dos vasos tumorais e não com o MVD. Essa baixa resistência ao fluxo sanguíneo dentro dos vasos tumorais e subsequente atividade das células endoteliais pode ser regulada por célula endotelial local ou célula muscular lisa vascular, síntese e liberação de arginina-vasopressina (AVP) com ações subsequentes nos receptores de vasopressina.

A arginina-vasopressina (AVP) é um hormônio peptídico classicamente conhecido por ser sintetizado no hipotálamo e secretado pela hipófise posterior. AVP tem uma variedade de papéis no corpo e uma variedade de funções fisiológicas sistêmicas para incluir vasoconstrição, gliconeogênese, corticogênese e excreção de água e uréia. A AVP causa uma vasoconstrição periférica que se acredita ser mediada principalmente pelo receptor V1. Acredita-se que o AVP faça isso por uma variedade de mecanismos para incluir a ativação dos receptores V1a com estimulação da fosfolipase A2, que leva ao aumento da atividade de pico de cálcio. AVP também poderia fazer isso regulando a expressão de outros fatores hipertensivos e proteínas no corpo. Foi demonstrado que a AVP desempenha um papel importante no desenvolvimento de hipertensão após constrição aórtica em ratos. Quando ratos receberam AVP após constrição da aorta abdominal, desenvolveu-se hipertensão e esses animais tiveram uma resposta aumentada à angiotensina II. Portanto, acredita-se que a AVP permita a expressão de outros fatores, como a angiotensina II. A presença de AVP é importante em outros modelos animais de hipertensão, como o rato espontaneamente hipertenso e a hipertensão sal DOCA. Por exemplo, a administração de sal DOCA a ratos Brattleboro, geneticamente incapazes de sintetizar vasopressina no hipotálamo, não resultará no desenvolvimento de hipertensão. No entanto, com a administração de AVP exógena, esses ratos desenvolverão hipertensão quando receberem tratamento com sal DOCA.

A exposição das células do músculo liso vascular ao AVP também aumenta a actina do músculo liso por meio da ativação de todas as três vias da família MAP quinase. Como o AVP tem a capacidade de regular e aumentar a actina do músculo liso, isso sugere que o AVP pode não apenas regular o crescimento do músculo liso vascular, mas também promover a expressão de proteínas contráteis específicas do músculo liso. Estudos anteriores mostraram que a AVP pode produzir uma vasoconstrição vascular exagerada em ratos jovens espontaneamente hipertensos (SHR) em relação a ratos normotensos. Esta resposta exagerada foi provavelmente associada a uma maior densidade de receptores V1 associados ao aumento da expressão do gene AVP. Finalmente, AVP e outros neuropeptídeos demonstraram servir como fatores de crescimento autócrinos para alguns tumores sólidos. Acredita-se que a influência mitogênica da AVP envolva aumentos no cálcio intracelular. AVP é frequentemente expressa em câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) e pode atuar como um fator de crescimento autócrino nesses cânceres. Acredita-se que a expressão de AVP em SCLC seja dependente da modulação da atividade repressora normal 12. Como o AVP tem sido implicado na fisiologia da constrição vascular e da pressão vascular média, e também porque foi demonstrado que é expresso em certos tipos de câncer, ele também pode ter um papel como fator angiogênico na vascularização intratumoral na carcinogênese do câncer de ovário. É o objetivo do nosso estudo proposto investigar a relação entre a expressão de AVP e seu receptor vascular com a histologia da neoplasia ovariana.

Resultados preliminares:

Recentemente, nossos laboratórios isolaram e analisaram artérias mesentéricas humanas para análises de mRNA de VP e de mRNA do receptor V1. V1R mRNA foi fortemente correlacionado positivamente com a pressão arterial diastólica (r = 0,70, p = 0,0112). O mRNA de V1R tendeu a ser maior em homens do que em mulheres (5,73 + 1,29 em comparação com 2,3 + 0,94 unidades de expressão relativa de mRNA de V1R, p = 0,057). Além disso, o mRNA da AVP arterial correlacionou-se negativamente com a idade (p=0,0028). Esses resultados sugerem que alterações na expressão de VP e V1R podem estar envolvidas em estados de doença, como câncer de ovário, onde a pressão sanguínea e o fluxo, bem como a idade, podem ser fatores no desenvolvimento da malignidade do tumor.

O peptídeo AVP foi medido por radioimunoensaio em outros vasos sanguíneos23, por ex. amostras de artéria radial e mamária e veia safena, e a imunoatividade mostrou co-migrar com AVP sintético na análise de HPLC. Os níveis de hormônio variaram de indetectáveis ​​até 60 uU/gr de tecido. Assim, também poderemos verificar alterações na expressão do gene VP medindo a proteína AVP diretamente nos vasos sanguíneos da neoplasia ovariana coletados.

6. PLANO: Serão inscritas no protocolo mulheres com idade igual ou superior a 18 anos que estejam realizando a retirada dos ovários. Serão obtidos 110 espécimes no total. Em nossa instituição, aproximadamente 200 pacientes por ano têm ovários removidos. Todos os pacientes que tiveram tecido ginecológico removido por indicações benignas (não cancerígenas) ou malignas (cancerígenas) atenderão aos critérios de inclusão. Os pacientes que têm uma malignidade que não é uma malignidade ginecológica primária serão excluídos do estudo. A vascularização intratumoral de cada paciente será avaliada por ultrassom Doppler e a pressão arterial sistêmica medida no pré-operatório.

PROCEDIMENTO PARA OBTENÇÃO, PREPARO E ENVIO DAS AMOSTRAS DE TECIDOS Amostras arteriais e venosas ovarianas serão coletadas para análise do peptídeo AVP e para AVP e mRNA do receptor de vasopressina. O pessoal da sala de cirurgia será solicitado a manter o tecido, a artéria ovariana e os segmentos de veia frescos e não colocá-los em fixador. Imediatamente após a remoção do tecido, as amostras serão preparadas da seguinte forma: O tecido primário mais estéril será cortado para medir pelo menos 5,0 cm de comprimento. O tecido tumoral será então separado de tanto tecido conjuntivo quanto possível. A amostra será colocada no conservante de RNA RNAlaterTM, colocada em gelo úmido e enviada aos Laboratórios do Departamento de Investigação Clínica rapidamente. As análises laboratoriais do peptídeo AVP e do isolamento e quantificação do mRNA do receptor de AVP e vasopressina serão realizadas nos laboratórios de Fisiologia e Farmacologia de Pesquisa do Departamento de Investigação Clínica.

Métodos laboratoriais: A síntese de vasopressina (indicada pelo mRNA de VP) e a regulação positiva ou negativa do receptor de vasopressina (V1R ou V2R) (conforme indicado pelos níveis de mRNA de V1R ou V2R) serão avaliadas. A medição de V2R além do mRNA de V1R ajudará a esclarecer se possíveis alterações na expressão de V1R nas neoplasias ovarianas são específicas para esse subtipo de receptor. Amostras de artéria ovariana serão isoladas e armazenadas em RNA later TM (Ambion, Austin, TX) a -70oC até serem extraídas para RNA com kit comercial (Invitrogen Carlsbad, CA). VP mRNA, V1R mRNA e beta actina mRNA serão quantificados por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) usando um iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA). A transcrição reversa do RNA para cDNA será feita usando Superscript TM (Invitrogen), e a PCR será feita com Platinum qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). Curvas padrão serão geradas usando diluições de um estoque de cDNA de vasos sanguíneos humanos e o limite do ciclo para cada amostra será relacionado ao número de cópias atribuído a uma diluição. Os dados de qPCR serão expressos como uma proporção de cópias de mRNA de VP, V1R ou V2R por cópias de mRNA de beta-actina. A geração do produto em todos os três segmentos de mRNA que estamos medindo, inclinações de rendimento de aproximadamente 3,3 indicando quase 100% de eficiência de uma duplicação do produto a cada ciclo de temperatura, e a eletroforese em gel indica uma banda do produto. Toda a quantificação é feita através da detecção de intensidade crescente de uma sonda fluorescente específica para cada produto.

O peptídeo vasopressina será analisado por radioimunoensaio de extratos de tecidos vasculares. O tecido será extraído primeiro enxaguando o tecido livre de sangue com ácido acético 0,1 N, manchando e pesando o tecido. A amostra será colocada em HCl 1,0 N frio (1ml/0,5 g de tecido) e homogeneizada com um Polytron por 1 min. O homogeneizado será então centrifugado a 27.000 G por 45 min. O sobrenadante será guardado e o pellet ressuspenso e novamente homogeneizado em 1 ml de HCl 1,0 N e centrifugado. Os sobrenadantes são então combinados. Os sobrenadantes serão então extraídos como rotineiramente feito com amostras de plasma por absorção em cartuchos de octadecilsilano (SepPak, C-18, Waters, Milford, MA) e eluídos com etanol acidificado. O eluato é seco por vácuo e suspenso em tampão de ensaio. Neste ponto, a amostra pode ser aplicada à coluna de HPLC C-18 e eluída em um sistema tampão de fase única que consiste em 0,05 M de NH4AC em 39% de MeOH e cada fração de 1 ml, seca sob vácuo e suspensa em tampão de radioimunoensaio e ensaiada . Alternativamente, o fracionamento de HPLC pode não ter que ser feito após a confirmação inicial de que nenhuma interferência está presente na amostra inicial. Neste caso, o extrato inicial será analisado diretamente por radioimunoensaio.