Bewertung von Vasopressin in den Gefäßen von Ovarialneoplasmen

D. STATUS: Hintergrund und Bedeutung/Vorstudien

Die Neovaskularisation ist ein obligatorisches frühes Ereignis beim Krebswachstum. Folglich scheint die Angiogenese eine wichtige Rolle bei der Krankheitsprogression und dem Überleben der meisten bösartigen Erkrankungen im Allgemeinen und gynäkologischen bösartigen Erkrankungen im Besonderen zu spielen. Eierstockkrebs ist die zweithäufigste gynäkologische Malignität und die häufigste krebsbedingte Todesursache unter den gynäkologischen Malignomen. Es wird geschätzt, dass 2003 in den Vereinigten Staaten 23.300 neue Fälle von Eierstockkrebs diagnostiziert werden und dass 13.900 Frauen an der Krankheit sterben werden. Angiogenese kann als prognostischer Indikator bei Eierstockkrebs dienen. Die Angiogenese bei Krebs erfordert die Proliferation und Migration von Endothelzellen als Antwort auf eine Vielzahl von Cytokinen, einschließlich Angiogenin, Endothelzell-Wachstumsfaktor und vaskulärer Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF). Die Expression einiger dieser Zytokine wurde bei gynäkologischen Malignomen untersucht. Eine erhöhte Expression des VEGF-Proteins durch Immunhistochemie wurde mit einem verringerten krankheitsfreien Überleben von 18 gegenüber 120 Monaten bei epithelialem Ovarialkarzinom im Frühstadium in Verbindung gebracht. Umgekehrt sollte jede Exposition gegenüber antiangiogenen Faktoren das Tumorzellwachstum in vitro hemmen. Es wurde auch festgestellt, dass Angiostatin und Endostatin das Wachstum von Eierstockkrebs bei Mäusen hemmen 7.

Die Neovaskularisierung, die von schnell wachsenden Malignomen im Allgemeinen und Eierstockkrebs im Besonderen benötigt wird, erfordert, dass sie viele neue Gefäße enthalten, die weniger glatte Muskulatur in ihren Wänden haben. Aufgrund der quantitativen Abnahme der glatten Gefäßmuskulatur haben diese Gefäße auch einen geringeren Widerstand gegen den Blutfluss als die Gefäße in gutartigen Tumoren. Es wurde gezeigt, dass bösartige Tumore mit niedrigem Gefäßwiderstand eine verringerte Expression von Aktin der glatten Muskulatur und eine intensive Cd34-Expression ohne Unterschiede in der Mikrogefäßdichte (MVD) aufweisen 8. Immunhistochemische Analyse unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und CD34 (eine Endothelzelle Marker) zeigten, dass ein niedriger Widerstand gegen den Blutfluss in Gefäßen innerhalb bösartiger Ovarialtumoren mit einer schlecht entwickelten Muskelschicht in den Tumorgefäßen verbunden sein kann, verglichen mit der, die bei gutartigen Tumoren beobachtet wird. Die Farbfluss-Doppler-Bildgebung verwendet die veränderten Blutflussmuster als Marker, um zu versuchen, gutartige von bösartigen Tumoren zu unterscheiden 9. Forscher haben das Vorhandensein einer intratumoralen Vaskularisierung in Ovarialneoplasmen durch Farbfluss-Doppler-Ultraschall bewertet. Gutartige Tumore und Zysten haben einen signifikant höheren Pulsatilitätsindex (PI) (Mittelwert 1,93 +/- 1,02; Bereich 0,23-3,99) und Widerstandsindex (RI) (Mittelwert 0,77 +/- 0,22; Bereich 0,2–1,0) als bösartige Tumore (PI: Mittelwert 0,77 +/- 0,33; Bereich 0,31–1,09; RI: Mittelwert, 0,5 +/- 0,17; Bereich 0,27–0,67). Es gibt jedoch einige Überschneidungen bei einzelnen Werten für gutartige und bösartige Läsionen. Der Unterschied in der angiogenen und gefäßresistenten Natur von gutartigen und bösartigen Eierstocktumoren, die einen intratumoralen Blutfluss zeigen, kann somit mit der Endothelzellaktivität der Tumorgefäße und nicht mit der MVD korreliert werden. Dieser geringe Widerstand gegen den Blutfluss innerhalb der Tumorgefäße und die anschließende Aktivität der Endothelzellen könnte durch lokale Endothelzellen oder glatte Gefäßmuskelzellen, Arginin-Vasopressin (AVP)-Synthese und -Freisetzung mit anschließenden Wirkungen auf Vasopressin-Rezeptoren reguliert werden.

Arginin-Vasopressin (AVP) ist ein Peptidhormon, von dem bekannt ist, dass es im Hypothalamus synthetisiert und von der hinteren Hypophyse ausgeschieden wird. AVP hat eine Vielzahl von Rollen im Körper und eine Vielzahl von systemischen physiologischen Funktionen, einschließlich Vasokonstriktion, Gluconeogenese, Corticosteroidogenese und Ausscheidung von Wasser und Harnstoff. AVP verursacht eine periphere Vasokonstriktion, von der angenommen wird, dass sie hauptsächlich durch den V1-Rezeptor vermittelt wird. Es wird angenommen, dass AVP dies durch eine Vielzahl von Mechanismen tut, einschließlich der Aktivierung der V1a-Rezeptoren mit Stimulation der Phospholipase A2, was zu einer erhöhten Calcium-Spike-Aktivität führt. AVP könnte dies auch tun, indem es die Expression anderer hypertensiver Faktoren und Proteine ​​im Körper reguliert. Es wurde gezeigt, dass AVP eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Bluthochdruck nach Aortenverengung bei Ratten spielt. Wenn Ratten AVP nach einer Verengung der abdominalen Aorta verabreicht wurde, entwickelte sich Bluthochdruck und diese Tiere reagierten verstärkt auf Angiotensin II. Daher wird angenommen, dass AVP die Expression anderer Faktoren wie Angiotensin II ermöglicht. Das Vorhandensein von AVP ist wichtig in anderen Tiermodellen für Bluthochdruck, wie der spontan hypertensiven Ratten- und DOCA-Salz-Hypertonie. Beispielsweise führt die Verabreichung von DOCA-Salz an Brattleboro-Ratten, die genetisch nicht in der Lage sind, Vasopressin im Hypothalamus zu synthetisieren, nicht zur Entwicklung von Bluthochdruck. Bei Verabreichung von exogenem AVP entwickeln diese Ratten jedoch Bluthochdruck, wenn ihnen eine Behandlung mit DOCA-Salz verabreicht wird.

Die Exposition von vaskulären glatten Muskelzellen gegenüber AVP erhöht auch das Aktin der glatten Muskulatur durch Aktivierung aller drei Wege der MAP-Kinase-Familie. Da AVP die Fähigkeit hat, Aktin der glatten Muskulatur zu regulieren und zu erhöhen, legt dies nahe, dass AVP nicht nur das Wachstum der vaskulären glatten Muskulatur regulieren, sondern auch die Expression von glattmuskelspezifischen kontraktilen Proteinen fördern kann. Frühere Studien haben gezeigt, dass AVP bei jungen spontan hypertensiven Ratten (SHR) im Vergleich zu normotensiven Ratten eine übertriebene vaskuläre Vasokonstriktion hervorrufen kann. Diese übertriebene Reaktion war wahrscheinlich mit einer höheren Dichte von V1-Rezeptoren verbunden, die mit einer erhöhten AVP-Genexpression verbunden waren. Schließlich wurde gezeigt, dass AVP und andere Neuropeptide als autokrine Wachstumsfaktoren für einige solide Tumore dienen. Es wird angenommen, dass der mitogene Einfluss von AVP eine Erhöhung des intrazellulären Calciums beinhaltet. AVP wird häufig bei kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC) exprimiert und kann bei diesen Krebsarten als autokriner Wachstumsfaktor wirken. Es wird angenommen, dass die AVP-Expression bei SCLC von der Modulation der normalen Repressoraktivität abhängt 12. Da AVP an der Physiologie der Gefäßverengung und des mittleren Gefäßdrucks beteiligt ist und auch, weil gezeigt wurde, dass es bei bestimmten Krebsarten exprimiert wird, kann es auch eine Rolle als angiogener Faktor bei der intratumoralen Vaskularisierung bei der Karzinogenese von Eierstockkrebs spielen. Es ist der Zweck unserer vorgeschlagenen Studie, die Beziehung zwischen der AVP-Expression und ihrem vaskulären Rezeptor mit der Histologie von Ovarialneoplasmen zu untersuchen.

Vorläufige Ergebnisse:

Kürzlich haben unsere Labors menschliche Mesenterialarterien für VP-mRNA- und V1-Rezeptor-mRNA-Analysen isoliert und analysiert. V1R-mRNA war stark positiv mit dem diastolischen Blutdruck korreliert (r = 0,70, p = 0,0112). V1R-mRNA war bei Männern tendenziell größer als bei Frauen (5,73 + 1,29 im Vergleich zu 2,3 ​​+ 0,94 relativen Expressionseinheiten von V1R-mRNA, p = 0,057). Auch die arterielle AVP-mRNA korrelierte negativ mit dem Alter (p = 0,0028). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Veränderungen sowohl der VP- als auch der V1R-Expression an Krankheitszuständen wie Eierstockkrebs beteiligt sein könnten, bei denen Blutdruck und Blutfluss sowie das Alter Faktoren bei der Entwicklung der Malignität des Tumors sein können.

Das AVP-Peptid wurde durch Radioimmunoassay in anderen Blutgefäßen gemessen23, z. Speichen- und Brustarterien- und Saphenusvenenproben, und es wurde gezeigt, dass die Immunaktivität bei HPLC-Analyse mit synthetischem AVP co-migriert. Die Hormonspiegel reichten von nicht nachweisbar bis zu 60 uU/g Gewebe. Somit werden wir auch in der Lage sein, Änderungen in der VP-Genexpression zu verifizieren, indem wir das AVP-Protein direkt in den entnommenen Blutgefäßen der Ovarialneoplasie messen.

6. PLAN: Frauen ab 18 Jahren, deren Eierstöcke entfernt werden, werden in das Protokoll aufgenommen. Es werden insgesamt 110 Exemplare erhalten. An unserer Einrichtung werden jährlich etwa 200 Patientinnen Eierstöcke entfernt. Alle Patientinnen, denen gynäkologisches Gewebe aus gutartigen (nicht krebsartigen) oder bösartigen (krebsartigen) Indikationen entfernt wurde, erfüllen die Einschlusskriterien. Patientinnen mit einer Malignität, die keine primäre gynäkologische Malignität ist, werden von der Studie ausgeschlossen. Die intratumorale Vaskularität jedes Patienten wird durch Doppler-Ultraschall beurteilt und präoperativ der systemische Blutdruck gemessen.

VERFAHREN ZUR BESCHAFFUNG, VORBEREITUNG UND VERSAND VON GEWEBEPROBEN Arterielle und venöse Eierstockproben werden zur Analyse des AVP-Peptids und der AVP- und Vasopressinrezeptor-mRNA entnommen. Das OP-Personal wird gebeten, das Gewebe, die Arterien- und Venensegmente der Eierstöcke frisch zu halten und nicht in Fixiermittel zu legen. Unmittelbar nach der Gewebeentnahme werden die Proben wie folgt präpariert: Das sterilste Primärgewebe wird auf eine Länge von mindestens 5,0 cm geschnitten. Das Tumorgewebe wird dann von möglichst viel Bindegewebe getrennt. Die Probe wird in das RNA-Konservierungsmittel RNAlaterTM gegeben, auf Nasseis gelegt und schnell an die Labore der Abteilung für klinische Untersuchungen geschickt. Laboranalysen des AVP-Peptids und zur Isolierung und Quantifizierung von AVP- und Vasopressinrezeptor-mRNA werden in den Labors für Physiologie und Forschungspharmakologie der Abteilung für klinische Untersuchungen durchgeführt.

Labormethoden: Vasopressin-Synthese (wie durch VP-mRNA angezeigt) und Vasopressin-Rezeptor (V1R oder V2R) Hoch- oder Herunterregulation (wie durch V1R-mRNA- oder V2R-mRNA-Spiegel angezeigt) werden bewertet. Die Messung von V2R zusätzlich zur V1R-mRNA hilft bei der Klärung, ob mögliche Veränderungen in der V1R-Expression in den Eierstock-Neoplasmen spezifisch für diesen Rezeptor-Subtyp sind. Eierstockarterienproben werden isoliert und in RNA later TM (Ambion, Austin, TX) bei -70 °C gelagert, bis sie mit einem kommerziellen Kit (Invitrogen Carlsbad, CA) auf RNA extrahiert werden. VP-mRNA, V1R-mRNA und Beta-Actin-mRNA werden durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) unter Verwendung eines iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA) quantifiziert. Die reverse Transkription der RNA zu cDNA erfolgt mit Superscript TM (Invitrogen) und die PCR mit Platinum qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). Standardkurven werden unter Verwendung von Verdünnungen eines Vorrats an menschlicher Blutgefäß-cDNA erstellt, und der Zyklusschwellenwert für jede Probe wird mit der einer Verdünnung zugewiesenen Kopienzahl in Beziehung gesetzt. qPCR-Daten werden als Verhältnis von VP-, V1R- oder V2R-mRNA-Kopien pro beta-Aktin-mRNA-Kopien ausgedrückt. Produkterzeugung auf allen drei mRNA-Segmenten, die wir messen, Ausbeutesteigungen von etwa 3,3, was eine fast 100%ige Effizienz einer Produktverdopplung mit jedem Temperaturzyklus anzeigt, und Gelelektrophorese zeigt eine Produktbande an. Die gesamte Quantifizierung erfolgt durch den Nachweis der zunehmenden Intensität einer spezifischen fluoreszierenden Sonde für jedes Produkt.

Das Vasopressin-Peptid wird durch Radioimmunoassay von Gefäßgewebeextrakten analysiert. Das Gewebe wird extrahiert, indem das Gewebe zuerst mit 0,1 N Essigsäure blutfrei gespült, abgetupft und das Gewebe gewogen wird. Die Probe wird in kalte 1,0 N HCl (1 ml/0,5 g Gewebe) gegeben und 1 Minute lang mit einem Polytron homogenisiert. Das Homogenat wird dann 45 min bei 27.000 G zentrifugiert. Der Überstand wird aufbewahrt und das Pellet resuspendiert und erneut in 1 ml 1,0 N HCl homogenisiert und zentrifugiert. Die Überstände werden dann vereinigt. Die Überstände werden dann wie routinemäßig mit Plasmaproben durch Absorption auf Octadecylsilankartuschen (SepPak, C-18, Waters, Milford, MA) extrahiert und mit angesäuertem Ethanol eluiert. Das Eluat wird vakuumgetrocknet und in Assay-Puffer suspendiert. An diesem Punkt kann die Probe auf eine C-18-HPLC-Säule aufgetragen und in einem einphasigen Puffersystem bestehend aus 0,05 M NH4AC in 39 % MeOH und jeder 1-ml-Fraktion eluiert, unter Vakuum getrocknet und in Radioimmunoassay-Puffer suspendiert und getestet werden . Alternativ muss die HPLC-Fraktionierung möglicherweise nicht durchgeführt werden, nachdem zunächst bestätigt wurde, dass keine Interferenz in der ursprünglichen Probe vorhanden ist. In diesem Fall wird der Ausgangsextrakt direkt durch Radioimmunoassay getestet.