Evaluering av vasopressin i karene til ovarieneoplasmer

d. STATUS: Bakgrunn og betydning/Forstudier

Neovaskularisering er en obligatorisk tidlig hendelse i kreftvekst. Følgelig ser det ut til at angiogenese spiller en viktig rolle i sykdomsprogresjon og overlevelse av de fleste maligniteter generelt og gynekologiske maligniteter spesifikt. Eggstokkreft er den nest vanligste gynekologiske maligniteten, og den viktigste årsaken til kreftrelatert død blant de gynekologiske malignitetene. Det er anslått at 23 300 nye tilfeller av eggstokkreft vil bli diagnostisert i USA i 2003 og at 13 900 kvinner vil dø av sykdom. Angiogenese kan tjene som en prognostisk indikator ved eggstokkreft. Angiogenese i kreft krever spredning og migrering av endotelceller som respons på en rekke cytokiner som inkluderer angiogenin, endotelcellevekstfaktor og vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF). Uttrykket av noen av disse cytokinene har blitt evaluert ved gynekologiske maligniteter. Økt ekspresjon av VEGF-protein ved immunhistokjemi har vært assosiert med redusert sykdomsfri overlevelse 18 versus 120 måneder i tidlig stadium av epitelial eggstokkreft. Omvendt bør enhver eksponering for antiangiogene faktorer hemme tumorcellevekst in vitro. Angiostatin og endostatin har også vist seg å hemme eggstokkreftvekst hos mus 7.

Neovaskulariseringen som kreves av raskt voksende maligniteter generelt, og eggstokkreft spesifikt, nødvendiggjør at de inneholder mange nye kar som har mindre glatt muskulatur i veggene. På grunn av den kvantitative reduksjonen i vaskulær glatt muskel har disse karene også en redusert motstand mot blodstrøm enn karene som finnes i godartede svulster. Ondartede svulster med lav vaskulær motstand har vist seg å vise redusert glattmuskelaktinekspresjon og intens Cd34-ekspresjon uten forskjeller i mikrokartetthet (MVD) notert 8. Immunhistokjemisk analyse ved bruk av monoklonale antistoffer mot glattmuskelaktin (SMA) og CD34 (en endotelcelle) markør) viste at lav motstand mot blodstrøm i kar i ondartede eggstoksvulster kan være assosiert med en dårlig utviklet muskelpels i tumorkarene, sammenlignet med den som er observert i godartede svulster. Color-flow Doppler-avbildning bruker de endrede blodstrømsmønstrene som en markør i et forsøk på å skille godartede fra ondartede svulster 9. Forskere har evaluert tilstedeværelsen av intratumoral vaskularisering i ovarie-neoplasmer ved Color-flow Doppler-ultralyd. Godartede svulster og cyster har en betydelig høyere pulsatilitetsindeks (PI) (gjennomsnitt, 1,93 +/- 1,02; område, 0,23-3,99) og resistiv indeks (RI) (gjennomsnitt, 0,77 +/- 0,22; område, 0,2-1,0) enn ondartede svulster (PI: gjennomsnitt, 0,77 +/- 0,33; område, 0,31-1,09; RI: gjennomsnitt, 0,5 +/- 0,17; område, 0,27-0,67). Noe overlapping eksisterer imidlertid i individuelle verdier for benigne og ondartede lesjoner. Forskjellen i den angiogene og vaskulære resistente naturen til benigne og ondartede ovarietumorer som viser intratumoral blodstrøm kan dermed korreleres med endotelcelleaktiviteten til tumorkarene og ikke MVD. Denne lave motstanden mot blodstrøm i tumorkar og påfølgende endotelcelleaktivitet kan reguleres av lokal, endotelcelle eller vaskulær glattmuskelcelle, arginin-vasopressin (AVP) syntese og frigjøring med påfølgende virkninger på vasopressinreseptorer.

Arginin-vasopressin (AVP) er et peptidhormon som er klassisk kjent for å syntetiseres i hypothalamus og skilles ut av den bakre hypofysen. AVP har en rekke roller i kroppen og en rekke systemiske fysiologiske funksjoner som inkluderer vasokonstriksjon, glukoneogenese, kortikosteroidogenese og utskillelse av vann og urea. AVP forårsaker en perifer vasokonstriksjon som antas å være mediert primært av V1-reseptoren. AVP antas å gjøre dette ved en rekke mekanismer for å inkludere aktivering av V1a-reseptorene med stimulering av fosfolipase A2 som fører til økt kalsiumspikingsaktivitet. AVP kan også gjøre dette ved å regulere uttrykket av andre hypertensive faktorer og proteiner i kroppen. AVP har vist seg å spille en viktig rolle i utviklingen av hypertensjon etter aortakonstriksjon hos rotter. Når rotter ble gitt AVP etter innsnevring av abdominal aorta, utviklet hypertensjon og disse dyrene hadde en økt respons på angiotensin II. Derfor antas AVP å tillate ekspresjon av andre faktorer som angiotensin II. Tilstedeværelsen av AVP er viktig i andre dyremodeller av hypertensjon, slik som spontan hypertensiv rotte og DOCA salt hypertensjon. For eksempel vil administrering av DOCA-salt til Brattleboro-rotter, genetisk ute av stand til å syntetisere vasopressin i hypothalamus, ikke resultere i utvikling av hypertensjon. Men med administrering av eksogen AVP vil disse rottene utvikle hypertensjon når de får DOCA-saltbehandling.

Eksponering av vaskulære glatte muskelceller for AVP øker også glattmuskelaktin gjennom aktivering av alle tre MAP-kinasefamilieveiene. Fordi AVP har evnen til å regulere og øke glattmuskelaktin, antyder dette at AVP ikke bare kan regulere veksten av vaskulær glatt muskel, men også fremme uttrykk for glattmuskelspesifikke kontraktile proteiner. Tidligere studier har vist at AVP kan gi en overdreven vaskulær vasokonstriksjon hos unge spontant hypertensive rotter (SHR) i forhold til normotensive rotter. Denne overdrevne responsen var sannsynligvis assosiert med en høyere tetthet av V1-reseptorer assosiert med økt AVP-genekspresjon. Til slutt har AVP og andre neuropepetider vist seg å tjene som autokrine vekstfaktorer for noen solide svulster. Den mitogene påvirkningen av AVP antas å involvere økninger i intracellulært kalsium. AVP kommer ofte til uttrykk ved småcellet lungekreft (SCLC), og kan fungere som en autokrin vekstfaktor i disse kreftformene. AVP-uttrykk i SCLC antas å være avhengig av moduleringen av normal repressoraktivitet 12. Fordi AVP har vært implisert i fysiologien til vaskulær innsnevring og gjennomsnittlig vaskulært trykk, og også fordi det har vist seg å komme til uttrykk i visse typer kreft, kan det også ha en rolle som en angiogen faktor i intratumoral vaskularisering ved karsinogenese av eggstokkreft. Det er hensikten med vår foreslåtte studie å undersøke forholdet mellom AVP-uttrykk og dens vaskulære reseptor med ovarie-neoplasma-histologi.

Foreløpige resultater:

Nylig har laboratoriene våre isolert og analysert humane mesenteriske arterier for VP mRNA og V1 reseptor mRNA analyser. V1R mRNA var sterkt positivt korrelert med diastolisk blodtrykk (r = 0,70, p = 0,0112). V1R mRNA hadde en tendens til å være større hos menn enn hos kvinner (5,73 + 1,29 sammenlignet med 2,3 + 0,94 relative ekspresjonsenheter av V1R mRNA, p = 0,057). Arteriell AVP mRNA korrelerte også negativt med alder (p=0,0028). Disse resultatene tyder på at endringer i både VP- og V1R-ekspresjon kan være involvert i sykdomstilstander som eggstokkreft hvor blodtrykk og flyt samt alder kan være faktorer i utviklingen av svulstens malignitet.

AVP-peptidet ble målt ved radioimmunoassay i andre blodårer23, f.eks. radial- og brystarterie- og saphenøsveneprøver, og immunaktiviteten ble vist å migrere sammen med syntetisk AVP på HPLC-analyse. Nivåene av hormon varierte fra uoppdagelige til så høye som 60 uU/gr vev. Dermed vil vi også være i stand til å verifisere endringer i VP-genekspresjon ved å måle AVP-proteinet direkte i ovarieneoplasmablodårene samlet.

6. PLAN: Kvinner, 18 år eller eldre, som får fjernet eggstokkene vil bli registrert i protokollen. Totalt 110 prøver vil bli oppnådd. Ved vår institusjon får ca. 200 pasienter per år fjernet eggstokker. Alle pasienter som har fått fjernet gynekologisk vev for godartede (ikke kreft) eller ondartede (kreft) indikasjoner vil oppfylle inklusjonskriteriene. Pasienter som har en malignitet som ikke er en primær gynekologisk malignitet vil bli ekskludert fra studien. Hver pasients intratumorale vaskularitet vil bli vurdert ved doppler-ultralyd og systemisk blodtrykk målt preoperativt.

PROSEDYRE FOR ANSKAFFELSE, KLARGJØRING OG FORSENDELSE AV VELVPRØVER Ovariale arterielle og venøse prøver vil bli samlet inn for analyse av AVP-peptid og for AVP- og vasopressinreseptor-mRNA. Operasjonsromspersonell vil bli bedt om å holde vevet, ovariearterie og venesegmenter friske og ikke legge det i fiksativ. Umiddelbart etter fjerning av vevet, vil prøvene bli klargjort som følger: Det mest sterile primærvevet vil bli kuttet for å måle minst 5,0 cm i lengde. Svulstvevet vil da skilles fra så mye bindevev som mulig. Prøven vil bli plassert i RNA-konserveringsmidlet RNAlaterTM, plassert på våt is og sendt til Institutt for kliniske undersøkelseslaboratorier raskt. Laboratorieanalyser av AVP-peptid og for AVP- og vasopressinreseptor-mRNA-isolering og kvantifisering vil bli utført i fysiologi og forskningsfarmakologiske laboratorier ved Institutt for klinisk undersøkelse.

Laboratoriemetoder: Vasopressinsyntese (som indikert av VP mRNA) og vasopressinreseptor (V1R eller V2R) opp eller ned regulering (som indikert av V1R mRNA eller V2R mRNA nivåer) vil bli vurdert. Måling av V2R i tillegg til V1R mRNA vil bidra til å avklare om mulige endringer i V1R-ekspresjon i ovarieneoplasmene er spesifikke for den reseptorsubtypen. Ovarian arterie prøver vil bli isolert og lagret i RNA senere TM (Ambion, Austin, TX) ved -70oC inntil ekstrahert for RNA med et kommersielt sett (Invitrogen Carlsbad, CA). VP mRNA, V1R mRNA og beta actin mRNA vil bli kvantifisert ved kvantitativ sanntids PCR (qPCR) ved bruk av en iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Revers transkripsjon av RNA til cDNA vil bli gjort ved hjelp av Superscript TM (Invitrogen), og PCR vil bli gjort med Platinum qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). Standardkurver vil bli generert ved å bruke fortynninger av en bestand av humant blodkar-cDNA, og syklusterskelen for hver prøve vil være relatert til en fortynnings tildelt kopinummer. qPCR-data vil bli uttrykt som et forhold mellom VP-, V1R- eller V2R-mRNA-kopier per beta-aktin-mRNA-kopier. Produktgenerering på alle tre mRNA-segmenter vi måler, gir hellinger på omtrent 3,3, noe som indikerer nesten 100 % effektivitet av en dobling av produktet med hver syklus i temperatur, og gelelektroforese indikerer ett produktbånd. All kvantifisering gjøres gjennom deteksjon av økende intensitet av en spesifikk fluorescerende probe for hvert produkt.

Vasopressinpeptid vil bli analysert ved radioimmunoassay av vaskulære vevsekstrakter. Vevet vil bli ekstrahert ved først å skylle vevet fri for blod med 0,1 N Eddiksyre, blotting og veiing av vevet. Prøven plasseres i kald 1,0 N HCl (1 ml/0,5 g vev) og homogeniseres med en Polytron i 1 min. Homogenatet vil deretter bli sentrifugert ved 27 000 G i 45 min. Supernatanten vil bli lagret, og pelleten resuspendert og rehomogenisert i 1 ml 1,0 N HCl, og sentrifugert. Supernatantene kombineres deretter. Supernatantene vil deretter bli ekstrahert som rutinemessig gjort med plasmaprøver ved absorpsjon på oktadecylsilan-patroner (SepPak, C-18, Waters, Milford, MA) og eluert med surgjort etanol. Eluatet tørkes ved vakuum og suspenderes i analysebuffer. På dette tidspunktet kan prøven påføres C-18 HPLC-kolonne og elueres i et enkeltfasebuffersystem bestående av 0,05 M NH4AC i 39 % MeOH, og hver 1-ml fraksjon, tørket under vakuum og suspendert i radioimmunanalysebuffer og analysert . Alternativt kan det hende at HPLC-fraksjoneringen ikke må gjøres etter første bekreftelse på at ingen interferens er tilstede i den første prøven. I dette tilfellet vil det første ekstraktet bli analysert ved radioimmunoassay direkte.