암에 걸린 어린 소년의 생식력 보존을 위한 사춘기 전 고환 조직의 냉동보존

목표

1. 주요 목표

   a) 생식능력을 보존하기 위해 향후 치료 용도로 사용하기 위해 잠재적으로 살균 치료를 받고 있는 사춘기 전 및 사춘기 전후 환자의 고환 조직을 냉동보존합니다.

   나. 포함 및 제외 기준의 개발/정밀화 ii. 출산력 보존에 대한 이러한 접근 방식에 대한 환자와 부모의 태도 조사 iii. 이를 제공하기 위해 필요한 다학문적 그룹의 개발

2. 보조 목표

   1. 고환 조직 냉동 보존 후 추적 환자
   2. 실험실 연구 - 생식능력 보존을 위한 고환 생식세포 개발 i. 고환 조직에 대한 최적의 동결 방법 개발 ii. 생식세포 성숙을 위한 체외 배양 방법 iii. 생식세포의 성숙을 위한 이종이식 접근법의 개발

사춘기 전 및 사춘기 소년에 대한 전향적 코호트 연구 설계

연구 집단 후속 불임의 위험이 높은 치료를 받고 있는 사춘기 전 및 사춘기 주변 소년

주요 연구 종점 불임 보존에 잠재적인 향후 사용을 위한 고환 조직의 성공적인 장기 냉동 보관 및 고환 생검이 후속 내분비 기능에 미치는 영향에 대한 환자 추적

조직의 장기 보관을 지원하는 방법 및 생체 내/체외 정자 형성 방법 개발을 위한 실험실 기술 확립

행동 양식

환자 모집 환자는 에딘버러에 있는 RHCYP의 종양학과에서 모집됩니다. 고환 냉동 보존은 포함 기준을 충족하는 적격 환자에게 제공됩니다. 연령에 맞는 환자 정보 시트가 환자에게 제공됩니다.

환자 동의 동의는 고환 조직 냉동 보존 및 보관에 대한 것입니다. 환자는 조직을 연구 목적으로 사용하도록 허용할 수도 있지만, 이러한 측면을 거부한다고 해서 조직의 냉동 보존에 동의하는 것을 막을 수는 없습니다. 연구 환자의 나이가 어리고 미성숙하기 때문에, 환자가 스스로 완전한 동의를 할 수 있다고 간주되지 않는 한, 전신 마취 하 고환 생검에 대한 서면 동의서는 환자의 부모/보호자로부터 얻을 것입니다. 나이가 어려 서면 동의서를 제공할 능력이 없는 것으로 간주되는 소년들로부터 환자의 동의를 구하게 됩니다.

수술 절차 고환 생검은 암 생식선 독성 치료가 시작되기 전에 RHCYP의 수술실에서 실시됩니다. 이는 가능하다면 추가 마취의 필요성을 피하기 위해 전신 마취가 필요한 계획된 일상적 시술과 일치하므로 이로 인해 치료 시작이 지연되지 않습니다. 조직 보관에 필요한 바이러스 검사를 위해 혈액 샘플을 채취합니다. 혈액 샘플은 조직 서비스 및 HTA에서 시간이 지남에 따라 요구되는 전염병에 대한 추가 테스트를 위해 보관됩니다.

고환 부피는 수술 시 육안 검사와 수동 촉진을 통해 평가됩니다. 제거되는 조직의 양은 일반적으로 약 0.6-0.8ml입니다. 고환 하나에서 채취하며, 단일 고환 전체 부피의 50%를 초과하지 않습니다. 이 절차에는 음낭 절개를 통한 일측 개방 고환 생검이 포함됩니다.

세포독성 치료는 생검 이전에 시작되지 않으므로 감염 위험은 최소화됩니다. 고형 종양 환자의 경우 혈소판 수와 기능이 일반적으로 정상이므로 출혈은 큰 문제가 되지 않습니다. 백혈병 환자의 경우 진단 당시 혈소판 감소증이 존재할 가능성이 높지만 이러한 환자의 수술 과정에서 지혈은 일상적으로 혈소판 수혈을 통해 확보됩니다.

고환 조직 냉동 보존을 위해 생검을 실시하며, 샘플의 일부는 실험실 연구용으로 사용됩니다(이 목적에 대해 동의를 얻은 경우). 사춘기 환자의 경우, 숙련된 발생학자가 표준 방법을 사용하여 정자의 존재 여부를 확인하기 위해 냉동 보존할 조직을 즉시 분석합니다. 정자가 존재하는 경우 샘플의 일부는 고환 정자 추출(TESE) 및 보관에 사용되며 나머지 조직은 아래 설명된 방법을 사용하여 냉동 보존됩니다.

고환 조직의 냉동 보존 고환 조직은 HTA의 라이선스 조건에 따라 저장됩니다. 샘플을 멸균 Hank의 균형 식염수 용액(HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgium)에 수집하고 냉동보존 및 보관을 위해 Tissue Services로 운반합니다.

1. 미성숙 고환 조직의 냉동 보존 ITT의 냉동 보존은 0.7 M DMSO(D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium)와 0.1 M 수크로스(+S; 10274-5c; VWR, Leuven, 벨기에) 및 이전에 기술된 바와 같은 10mg/ml HSA(Keros, Hultenby et al. 2007)(Wyns, Curaba et al. 2007). 평형화는 +4°C에서 30분 동안 수행됩니다. 프로그래밍 가능한 냉동고를 사용하여 바이알을 0°C에서 5분 동안 유지하면서 1°C/분으로 냉각한 다음 20°C까지 0.5°C/분으로 냉각합니다. 이 온도에서는 수동 시딩을 허용하기 위해 프로그램이 10분 동안 보류됩니다. 프로그램은 240°C까지 0.5°C/분의 속도로 계속되고, 10분 동안 유지된 후, 7°C/분의 속도로 270°C까지 계속되고, 이어서 액체 질소에 주입됩니다.
2. 성숙한 고환 조직의 냉동 보존 각 생검은 2.5% HSA가 보충된 2mL HBSS 또는 인간 세관액(Verheyen, De Croo et al. 1995)이 보충된 페트리 접시에 두 개의 가는 바늘을 사용하여 조심스럽게 잘게 다져졌습니다. 조직/세포 현탁액을 500g에서 10분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후, 펠릿을 2.5% HSA가 보충된 200μL HBSS 또는 인간 세관액에 재현탁합니다. SpermFreeze(Vitrolife)(1:1(v/v)의 비율로 현탁액에 천천히 첨가됩니다. 37°C에서 20분 동안 평형을 유지한 후 정자 현탁액을 500μL 크리요스트로(IMV, l'Aigle Cedex, France)로 흡입합니다. 냉각 및 냉동은 사정된 정자에 대한 표준 프로그램을 사용하여 컴퓨터 제어 하에 수행됩니다(Verheyen, Pletincx et al. 1993). 빨대를 프로그래밍 가능한 생물학적 냉동고의 챔버에 넣고 다음 프로그램에 따라 냉각합니다: (i) 실온에서 4°C까지 -1°C/분의 냉각 속도 (ii) 1분 동안 유지 (iii) 냉동 4°C에서 -80°C까지 -5°C/분의 속도로 (iv) 액체 질소(-196°C)에 담급니다.

실험실 연구 이 응용 프로그램의 주요 목적은 필요한 경우 향후 생식력 보존을 위해 사용할 수 있는 환자의 고환 조직을 저장하는 것입니다. 그러나 실험실 연구를 위해 조직의 추가 부분을 사용하는 경우에도 동의를 구해야 합니다. 위에서 설명한 대로 조직을 얻는 것 외에도 연구자는 협력 센터(영국 옥스포드에 있는 John Radcliffe 병원)에서 얻은 대체 조직 공급원에서 얻은 조직을 사용할 것입니다. 인간 사춘기 전 고환 물질의 이 두 번째 출처는 동물 연구를 포함하여 승인된 연구에서 조직을 사용하기 위해 이전에 동의를 얻은 HTA 라이센스(참조: 11106)에 따라 저장됩니다.

이 고환 조직은 실험실 연구의 세 가지 주요 측면에 사용됩니다.

1. 사춘기 전 고환 조직 및 세포에 대한 최적의 동결 방법

   임상 적용을 고려하기 전에 이종 무함유 임상 등급 구성 요소를 사용하여 냉동 조건을 최적화하고 개선해야 합니다. 연구자들은 연구를 위해 채취한 사춘기 전 조직 부분 내에서 생식 세포의 생존 및 발달 잠재력에 대한 다양한 동결 방지제의 사용을 평가할 것입니다. 해동 후 생존 가능성과 기능성은 면역조직화학, 유세포 분석 및 RT-PCR을 통해 평가됩니다. 동결 후 조직의 기능적 특성을 평가하기 위해 조직을 이종 이식하거나 체외 배양에 사용합니다.

2. 사춘기 전 고환 조직의 체외 배양

   연질 한천 시스템을 사용한 고환 조직 기관 배양은 신생아 마우스 고환을 사용하여 완전한 정자 생성을 가져왔습니다(Sato, Katagiri et al. 2011). 이 방법은 다양한 배양 배지, 혈청 및 생식 세포 분화를 자극하기 위한 성선 자극 호르몬/기타 성장 인자의 첨가의 효과를 조사함으로써 인간 사춘기 전 고환 조직에 사용하도록 조정될 것입니다. 이는 조직학적 분석과 정원세포에 대한 표지(예: 정자 세포)의 발현을 통해 평가됩니다. MAGE-A4, Thy-1), 정자세포(예: SCP-3, 프로히비틴(Prohibitin) 및 정자(예: Protamine-2, SP-10)은 qPCR, 유세포 분석 및 단백질 발현을 포함한 다양한 방법론으로 연구될 예정입니다. 다음 물질을 첨가하여 배양 조건을 수정하는 것이 고려됩니다: (1) 신생아 마우스 고환 조직 배양에서 완전한 정자 생성을 유도하는 녹아웃 혈청 대체(KO-SR)(Sato, Katagiri et al. 2011); (2) 감수분열과 정자형성 분화에 역할을 하는 것으로 알려진 레티노산; (3) 고농도의 테스토스테론인 테스토스테론은 생체 내 정자 형성에 필수적입니다.

3. 이종이식

고환 이종 이식은 정원 줄기 세포(SSC) 틈새를 확립하는 데 필요한 요인을 조사하기 위한 모델 시스템을 나타냅니다(Mitchell, Saunders et al. 2010). 고환 조직은 SSC 풀을 확립하기 위해 마우스에서 이소성(등 피부, 음낭, 신장 피막)으로 또는 고환에 직접 이종 이식됩니다. 연구자들은 확립된 고급 면역조직화학적 공동 위치화 연구를 사용하여 SSC 틈새의 유지에 책임이 있는 요인을 조사할 것입니다. 연구자들은 SSC와 체세포, 기저층 및 혈관계를 포함한 주변 틈새에서의 단백질 발현을 결정할 것입니다. 여기에는 c-kit/KITL 및 GDNF/Gfrα1과 같이 설치류에서 SSC 자가 재생/분화에 중요한 것으로 밝혀진 단백질이 포함됩니다. 체외 작업에 대해 설명된 것과 같은 감수분열 마커의 형태 및 발현을 조사하여 정조세포 단계를 넘어 생식 세포의 후속 분화를 조사하기 위해 이식편도 장기간 유지됩니다. 외인성 성선 자극 호르몬(LH/hCG +/- FSH)에 이종이식편을 노출시킴으로써 정자 형성 확립에 미치는 영향도 결정됩니다. 또한, 이종 이식 접근법을 사용하여 SSC를 얻은 다음 증식 및/또는 정세관으로 이식하여 집락화를 달성할 수 있습니다.

환자 후속 조치 환자는 에딘버러의 RHCYP에 있는 공동 종양학/내분비학 '지발 효과' 클리닉으로 이송될 때 더 이상 정기적인 감시 영상 촬영이 필요하지 않을 때까지 종양학 클리닉에서 정상적으로 추적 관찰을 받게 됩니다. 성장과 사춘기 상태를 모니터링하기 위해 아동기와 사춘기 동안 3개월마다 환자를 검토하게 됩니다. 후속 후속 조치는 3개월마다 또는 매년 이루어집니다. 사춘기는 Tanner Staging을 사용한 임상 검사와 성선 자극 호르몬, 테스토스테론 및 Inhibin B의 혈액 수준을 측정하여 평가됩니다. 고환 부피는 Prader 난초 측정기를 사용하여 측정되며 고환의 성장을 평가하고 모니터링하기 위해 매년 고환 초음파 검사를 수행합니다. 생검 결과로 인한 흉터 또는 손상. 주요 결과는 고환 생검을 받은 남아와 그렇지 않은 유사한 진단을 받은 남아에 비해 생식선 부전(정자 생성 및 내분비로 구분)의 유병률입니다. 이렇게 하면 생검으로 인해 부작용이 발생할 경우 이를 감지할 수 있으며 생검 및 고환 조직 냉동보존에 대한 선택 기준을 수정할 수도 있습니다.