Kryopræservering af præpubertal testikelvæv til bevarelse af fertilitet hos unge drenge med kræft

Mål

1. Primært mål

   a) Kryokonservering af testikelvæv fra præ- og peri-pubertale patienter, der gennemgår potentielt steriliserende terapi til fremtidig terapeutisk brug for at bevare fertiliteten.

   jeg. Udvikling/forfinelse af inklusions- og eksklusionskriterier ii. Udforskning af patienters og forældres holdning til denne tilgang til fertilitetsbevarelse iii. Udvikling af den nødvendige tværfaglige gruppe til at levere dette

2. Sekundære mål

   1. Opfølgningspatienter efter kryopræservering af testikelvæv
   2. Laboratorieforskning - udvikling af testikelkimceller til bevarelse af fertilitet i. Udvikling af optimale nedfrysningsmetoder til testikelvæv ii. In vitro dyrkningsmetoder til kønscellemodning iii. Udvikling af xenotransplantationsmetoder til modning af kønsceller

Design Prospektiv kohorteundersøgelse af præ- og peri-pubertale drenge

Undersøgelsespopulation Præ- og peri-pubertale drenge, der skal gennemgå terapi med høj risiko for efterfølgende infertilitet

Hovedundersøgelses endepunkt Vellykket langsigtet kryolagring af testikelvæv til potentiel fremtidig brug i fertilitetsbevarelse og opfølgning af patienter for virkninger af testikelbiopsi på efterfølgende endokrin funktion

Etablering af laboratorieteknikker til udvikling af metoder til at understøtte langtidsopbevaring af væv og metoder til in vivo/in vitro spermatogenese

Metoder

Patientrekruttering Patienter vil blive rekrutteret fra onkologisk afdeling på RHCYP i Edinburgh. Testikulær kryokonservering vil blive tilbudt til kvalificerede patienter, forudsat at de opfylder inklusionskriterierne. Alderspassende patientinformationsark vil blive udleveret til patienterne.

Patientsamtykke Samtykke vil være til kryopræservering og opbevaring af testikelvæv. Patienter vil også have mulighed for at tillade, at væv bruges til forskningsformål, men at afslå dette aspekt vil ikke forhindre dem i at give samtykke til kryopræservering af væv. På grund af undersøgelsespatienternes unge alder og umodenhed vil der indhentes skriftligt informeret samtykke til en testikelbiopsi under generel anæstesi fra patientens forældre/værge, medmindre patienterne anses for at kunne give fuldt informeret samtykke selv. Der vil blive indhentet patientsamtykke fra de drenge, der ikke anses for kompetente til at give skriftligt informeret samtykke på grund af deres unge alder.

Kirurgisk procedure Testikelbiopsien vil finde sted på operationsstuer på RHCYP, inden cancergonadotoksisk behandling påbegyndes. Dette vil, når det er muligt, falde sammen med en planlagt rutineprocedure, der kræver generel anæstesi for at undgå behov for yderligere bedøvelse, hvorfor dette ikke vil medføre forsinkelse af påbegyndelse af behandling. Der vil blive taget en blodprøve til virusscreening, som er et krav til vævsopbevaring. Blodprøven vil blive opbevaret for at muliggøre yderligere test for infektionssygdomme efter behov over tid af Tissues Services og MTV.

Testikelvolumen vil blive vurderet ved visuel inspektion og manuel palpation ved operationen. Mængden af ​​fjernet væv vil typisk være ca. 0,6-0,8 ml fra én testikel, og aldrig over 50 % af det samlede volumen af ​​en enkelt testikel. Proceduren vil involvere en ensidig åben testikelbiopsi gennem et skrotumsnit.

Da behandling med cellegift ikke vil være startet før biopsien, er risikoen for infektion minimal. Hos patienter med solide tumorer er det usandsynligt, at blødning er et stort problem, da blodpladetal og -funktion generelt er normale hos disse patienter. Hos patienter med leukæmi er trombocytopeni sandsynligvis til stede ved diagnosen, men hæmostase sikres rutinemæssigt ved blodpladetransfusion til operationelle procedurer hos disse patienter.

Biopsien vil blive taget til kryopræservering af testikelvæv, hvor en del af prøven går til laboratorieforskning (hvis samtykke er opnået til dette formål). Hos pubertetspatienter vil vævet til kryokonservering straks blive analyseret af en erfaren embryolog for tilstedeværelsen af ​​sæd ved hjælp af standardmetoder. Hvis sperm er til stede, vil en del af prøven blive brugt til testikelspermekstraktion (TESE) og opbevaring, mens resterende væv vil blive kryokonserveret ved hjælp af metoder beskrevet nedenfor.

Kryokonservering af testikelvæv Testisvæv vil blive opbevaret under MTV'ens licensbetingelser. Prøver opsamles i steril Hanks balancerede saltvandsopløsning (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgien) og transporteres til Tissue Services til kryokonservering og opbevaring.

1. Kryokonservering af umodent testikelvæv Kryokonservering af ITT udføres ved at placere to vævsstykker i hvert kryovial indeholdende 0,7 M DMSO (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgien) med 0,1 M saccharose (+S; 10274-5c; Belgien) og 10 mg/ml HSA som tidligere beskrevet (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). Ligevægt udføres ved +4°C i 30 min. Ved anvendelse af en programmerbar fryser afkøles hætteglassene ved 1°C/min. ved at holde ved 0°C i 5 minutter, efterfulgt af afkøling ved 0,5°C/min. indtil 20°C. Ved denne temperatur sættes programmet i bero i 10 minutter for at tillade manuel såning. Programmet fortsætter med en hastighed på 0,5°C/min indtil 240°C, holdt i 10 minutter og fortsættes til 270°C ved 7°C/min, med efterfølgende dykning i flydende nitrogen.
2. Kryokonservering af modent testikelvæv Hver biopsi hakkes forsigtigt med to fine nåle i en petriskål med 2 ml HBSS eller Human Tubule Fluid, suppleret med 2,5 % HSA (tilpasset fra Verheyen, De Croo et al. 1995). Efter centrifugering af væv/cellesuspensionen ved 500 g i 10 minutter og fjernelse af supernatanten resuspenderes pelleten i 200 µL HBSS eller Human Tubule Fluid, suppleret med 2,5 % HSA. SpermFreeze (Vitrolife) (tilsættes langsomt i et forhold på 1:1 (v/v) til suspensionen. Efter 20 minutters ækvilibrering ved 37°C aspireres sædsuspensionen i et 500 µL kryostrå (IMV, l'Aigle Cedex, Frankrig). Afkøling og frysning udføres under computerstyring under anvendelse af et standardprogram for ejakulerede spermatozoer (Verheyen, Pletincx et al. 1993). Sugerørene anbringes i kammeret i en programmerbar biologisk fryser og afkøles i henhold til følgende program: (i) kølehastighed på -1°C/min fra stuetemperatur til 4°C (ii) hold i 1 min. (iii) frysning hastighed på -5°C/min fra 4°C til -80°C (iv) dyk ned i flydende nitrogen (-196°C).

Laboratorieforskning Det primære formål med denne ansøgning er at opbevare testikelvæv fra patienter, som kan blive brugt i fremtiden til at bevare fertilitet, hvis det er nødvendigt. Der vil dog også blive søgt samtykke til brug af en ekstra portion væv til laboratorieforskning. Ud over at opnå væv som beskrevet ovenfor, vil efterforskerne også bruge væv opnået fra en alternativ kilde til væv opnået fra et samarbejdende center (John Radcliffe Hospital, Oxford, UK). Denne anden kilde til humant præpubertet testikelmateriale vil blive opbevaret under en MTV-licens (reference: 11106), hvor der tidligere er indhentet samtykke til brug af vævet i godkendt forskning, herunder dyreforskning.

Dette testikelvæv vil blive brugt til tre hovedaspekter af laboratorieforskning

1. Optimale nedfrysningsmetoder til præ-pubertale testisvæv og celler

   Fryseforhold skal optimeres og forbedres med xeno-frie komponenter af klinisk kvalitet, før klinisk anvendelse kan overvejes. Forskerne vil vurdere brugen af ​​forskellige kryobeskyttende midler på overlevelse og udviklingspotentiale af kønsceller i den del af præ-pubertalt væv, der tages til forskning. Levedygtighed og funktionalitet efter optøning vil blive vurderet ved immunhistokemi, flowcytometri og RT-PCR. For at evaluere vævets funktionelle egenskaber efter frysning, vil vævet blive xenotransplanteret eller brugt til in vitro-dyrkning.

2. In vitro kultur af præ-pubertalt testikelvæv

   Testisvævsorgankultur ved hjælp af et blødt agarsystem har resulteret i fuld spermatogenese ved brug af neonatale musetestis (Sato, Katagiri et al. 2011). Denne metode vil blive tilpasset til brug med humant præ-pubertalt testikelvæv ved at undersøge virkningerne af forskellige dyrkningsmedier, serum og tilsætning af gonadotropiner/andre vækstfaktorer for at stimulere kønscelledifferentiering. Dette vil blive evalueret ved histologisk analyse og ekspression af markører for spermatogoni (f.eks. MAGE-A4, Thy-1), spermatocytter (f.eks. SCP-3, Prohibitin) og spermatider (f.eks. Protamin-2, SP-10), som vil blive studeret med forskellige metoder, herunder qPCR, flowcytometri og proteinekspression. Ændringer af dyrkningsbetingelserne ved tilsætning af følgende stoffer vil blive overvejet: (1) Knock-out serumerstatning (KO-SR), da det inducerede fuldstændig spermatogenese i neonatal muse-testikelvævskultur (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) Retinsyre, da den har en kendt rolle i meiose og spermatogen differentiering; (3) Testosteron, da høje koncentrationer af testosteron er afgørende for spermatogenese in vivo.

3. Xenografting

Testis xenotransplantation repræsenterer et modelsystem til at undersøge de faktorer, der kræves for at etablere spermatogonial stamcelle (SSC) niche (Mitchell, Saunders et al. 2010). Testisvæv vil blive xenotransplanteret i mus, ektopisk (dorsal hud, scrotal, nyrekapsel) eller direkte ind i testiklen for at etablere SSC-puljen. Efterforskerne vil undersøge, hvilke faktorer der er ansvarlige for opretholdelsen af ​​SSC-nichen ved hjælp af etablerede avancerede immunhistokemiske co-lokaliseringsstudier. Efterforskerne vil bestemme proteinekspression i SSC'erne og den omgivende niche, herunder somatiske celler, basal lamina og vaskulatur. Dette vil omfatte proteiner, der har vist sig at være vigtige i SSC-selvfornyelse/differentiering hos gnavere, såsom c-kit/KITL og GDNF/Gfrα1. Transplantater vil også blive vedligeholdt i længere perioder for at undersøge efterfølgende differentiering af kønscellerne ud over spermatogonialstadiet ved at undersøge morfologi og ekspression af meiotiske markører som beskrevet for in vitro-arbejde. Effekterne på etableringen af ​​spermatogenese ved eksponering af xenotransplantater for eksogene gonadotropiner (LH/hCG +/- FSH) vil også blive bestemt. Ydermere vil xenotransplantationsmetoden blive brugt til at opnå SSC'er, som derefter kan formeres og/eller transplanteres i sædrør for at opnå kolonisering.

Opfølgning af patienter Patienter vil blive fulgt op i onkologisk klinik som normalt, indtil de ikke længere skal have regelmæssig billedovervågning, når de vil blive overført til den fælles onkologiske/endokrinologiske 'Senvirkningsklinik' på RHCYP i Edinburgh. Patienterne vil blive gennemgået hver 3. måned gennem barndommen og puberteten for at overvåge vækst og pubertetsstatus. Efterfølgende opfølgning vil være mellem 3 månedlige og årlige. Puberteten vil blive vurderet ved klinisk undersøgelse ved hjælp af Tanner Staging og også ved måling af blodniveauer af gonadotropiner, testosteron og Inhibin B. Testikelvolumen vil blive målt ved hjælp af et Prader orkidometer, og en årlig ultralyd af testiklerne vil blive udført for at vurdere testikelvækst og monitorering for ardannelse eller beskadigelse som følge af biopsien. Et nøgleresultat er forekomsten af ​​gonadal svigt (opdelt i spermatogen og endokrin) hos drenge, der har fået testikelbiopsier sammenlignet med dem med lignende og andre diagnoser, der ikke har. Dette vil sikre, at i det usandsynlige tilfælde, at der er uønskede virkninger af biopsien, vil dette blive opdaget, og det vil også tillade ændring af udvælgelseskriterierne for biopsi og testikelvævkryokonservering.