癌を患った少年の生殖能力を維持するための思春期前精巣組織の凍結保存

目的

1. 第一目的

   a) 妊孕性を維持するための将来の治療用途のために、潜在的に滅菌療法を受けている思春期前および思春期周辺の患者からの精巣組織の凍結保存。

   私。包含基準および除外基準の開発/改良 ii． 妊孕性温存に対するこのアプローチに対する患者と親の態度の調査 iii． これを提供するために必要な学際的なグループの開発

2. 二次的な目的

   1. 精巣組織凍結保存後のフォローアップ患者
   2. 臨床研究 - 妊孕性温存のための精巣生殖細胞の開発 i．精巣組織の最適な凍結法の開発 ii． 生殖細胞成熟のためのインビトロ培養法 iii． 生殖細胞の成熟のための異種移植アプローチの開発

思春期前および思春期前後の少年を対象とした前向きコホート研究の設計

研究対象集団 今後の不妊症のリスクが高い治療を受ける予定の思春期前および思春期前後の少年

主な研究エンドポイント 妊孕性温存における将来の使用の可能性を目的とした精巣組織の長期凍結保存の成功、およびその後の内分泌機能に対する精巣生検の影響についての患者の追跡調査

組織の長期保存をサポートする方法および生体内/体外での精子形成方法の開発のための実験技術の確立

メソッド

患者の募集 患者はエディンバラの RHCYP の腫瘍科から募集されます。 精巣の凍結保存は、対象となる患者が対象基準を満たしている場合に提供されます。 年齢に応じた患者情報シートが患者に提供されます。

患者の同意 同意は精巣組織の凍結保存と保管に対するものとなります。 患者には、組織を研究目的で使用することを許可するオプションもありますが、この側面を拒否しても、組織の凍結保存に同意することを妨げるものではありません。 研究対象患者の年齢が若く未熟であるため、患者自身が十分なインフォームド・コンセントを与えることができるとみなされる場合を除き、全身麻酔下での精巣生検に対する書面によるインフォームド・コンセントは患者の両親/保護者から取得されます。 年齢が若いために書面によるインフォームドコンセントを提供する能力がないとみなされる少年には、患者の同意が求められます。

外科的処置 精巣生検は、癌の性腺毒性治療を開始する前に、RHCYP の手術室で行われます。 これは、追加の麻酔の必要性を避けるために、全身麻酔を必要とする計画された日常処置と可能な限り一致するため、治療の開始が遅れることはありません。 組織保存の要件であるウイルススクリーニングのために血液サンプルが採取されます。 血液サンプルは、組織サービスおよび HTA の必要に応じて、感染症のさらなる検査を可能にするために保管されます。

精巣の体積は、手術時の視覚検査と手による触診によって評価されます。 除去される組織の量は通常約 0.6 ～ 0.8 ml です。 1 つの精巣から採取され、1 つの精巣の総体積の 50% を超えることはありません。 この手順には、陰嚢切開による片側の開腹精巣生検が含まれます。

細胞毒性療法による治療は生検の前には開始されないため、感染のリスクは最小限に抑えられます。 固形腫瘍の患者では血小板数と機能が一般に正常であるため、出血が大きな問題になる可能性は低いです。 白血病患者では、診断時に血小板減少症が存在する可能性が高いが、これらの患者の手術では血小板輸血によって止血が日常的に確保されている。

生検は精巣組織の凍結保存のために採取され、サンプルの一部は臨床研究に使用されます（この目的で同意が得られた場合）。 思春期の患者の場合、凍結保存する組織は、経験豊富な発生学者によって標準的な方法を使用して精子の存在について直ちに分析されます。 精子が存在する場合、サンプルの一部は精巣精子抽出 (TESE) と保管に使用され、残りの組織は以下に説明する方法を使用して凍結保存されます。

精巣組織の凍結保存 精巣組織は HTA のライセンス条項に基づいて保管されます。 サンプルは滅菌ハンクス平衡生理食塩水 (HBSS; 14175-129; Life Technologies、メレルベーケ、ベルギー) に収集され、凍結保存および保管のためにティッシュ サービスに輸送されます。

1. 未熟精巣組織の凍結保存 ITT の凍結保存は、0.1 M スクロース (+S; 10274-5c; VWR、ルーベン、ベルギー）および以前に記載されているように10 mg/ml HSA（Keros、Hultenby et al. 2007）（Wyns、Curaba et al. 2007）。 平衡化は+4℃で30分間行われます。 プログラム可能なフリーザーを使用して、バイアルを 0℃で 5 分間保持しながら 1℃/分で冷却し、続いて 20℃まで 0.5℃/分で冷却します。 この温度では、プログラムは 10 分間保留され、手動シードが可能になります。 このプログラムは、240℃まで0.5℃/分の速度で継続し、10分間保持し、7℃/分で270℃まで継続し、その後液体窒素に浸します。
2. 成熟精巣組織の凍結保存 各生検材料を、2.5% HSA を添加した 2 mL HBSS またはヒト尿細管液を入れたペトリ皿中で 2 本の細い針で慎重に刻みます (Verheyen, De Croo et al. 1995 から引用)。 組織/細胞懸濁液を 500 g で 10 分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを 2.5% HSA を添加した 200 μL HBSS またはヒト尿細管液に再懸濁します。 SpermFreeze (Vitrolife) (懸濁液に 1:1 (v/v) の比率でゆっくりと加えます。 37℃で 20 分間平衡化した後、精子懸濁液を 500 μL のクライオストロー (IMV、l'Aigle Cedex、フランス) に吸引します。 冷却と凍結は、射精された精子の標準プログラムを使用してコンピュータ制御下で実行されます (Verheyen, Pletincx et al. 1993)。 ストローをプログラム可能な生物学的冷凍庫のチャンバーに置き、次のプログラムに従って冷却します: (i) 室温から 4 ℃まで -1℃/分の冷却速度 (ii) 1 分間保持 (iii) 凍結-5°C/分の速度で 4°C から -80°C まで (iv) 液体窒素 (-196 °C) に浸漬します。

臨床研究 このアプリケーションの主な目的は、必要に応じて将来妊孕性を温存するために使用できる患者の精巣組織を保存することです。 ただし、実験室研究のために組織の余分な部分を使用する場合にも同意が求められます。 上述のように組織を入手することに加えて、研究者らは、協力センター（ジョン・ラドクリフ病院、オックスフォード、英国）から入手した代替組織源から得た組織も使用する。 このヒト思春期前精巣材料の 2 番目のソースは、動物研究を含む承認された研究における組織の使用について事前に同意が得られている HTA ライセンス (参照: 11106) に基づいて保管されます。

この精巣組織は、臨床研究の 3 つの主要な側面に使用されます。

1. 思春期前の精巣組織および細胞の最適な凍結方法

   臨床応用を検討する前に、ゼノフリーの臨床グレードの成分を使用して凍結条件を最適化し、改善する必要があります。 研究者らは、研究のために採取された思春期前の組織部分内の生殖細胞の生存と発生能力に対するさまざまな凍結保護剤の使用を評価する予定です。 解凍後の生存率と機能性は、免疫組織化学、フローサイトメトリー、RT-PCR によって評価されます。 凍結後の組織の機能特性を評価するには、組織を異種移植するか、体外培養に使用します。

2. 思春期前の精巣組織の体外培養

   軟寒天システムを使用した精巣組織器官培養により、新生仔マウス精巣を使用した完全な精子形成が得られました (Sato, Katajima et al. 2011)。 この方法は、生殖細胞の分化を刺激するためのさまざまな培地、血清、およびゴナドトロフィン/その他の成長因子の添加の効果を調査することにより、ヒトの思春期前の精巣組織での使用に適応されます。 これは、組織学的分析と精原細胞のマーカーの発現によって評価されます（例、精原細胞）。 MAGE-A4、Thy-1）、精母細胞（例、 SCP-3、プロヒビチン）および精子細胞（例： プロタミン-2、SP-10) は、qPCR、フローサイトメトリー、タンパク質発現などのさまざまな方法論で研究されます。 以下の物質を添加することによる培養条件の変更が検討されるであろう：（１）新生仔マウス精巣組織培養において完全な精子形成を誘導するためのノックアウト血清置換（ＫＯ－ＳＲ）（Ｓａｔｏ、Ｋａｔａｇｉｒｉら、２０１１）。 (2) レチノイン酸。減数分裂と精子形成分化における役割が知られています。 (3) 高濃度のテストステロンは、生体内での精子形成に不可欠です。

3. 異種移植

精巣異種移植は、精原幹細胞（SSC）ニッチを確立するために必要な因子を調査するためのモデルシステムを表します（Mitchell、Saunders et al. 2010）。 精巣組織は、SSCプールを確立するために、マウスに異所的に(背部皮膚、陰嚢、腎被膜)、または精巣に直接異種移植されます。 研究者らは、確立された高度な免疫組織化学的共局在研究を使用して、どの因子がSSCニッチの維持に関与しているかを調べる予定です。 研究者らは、SSC および体細胞、基底層、血管系などの周囲のニッチにおけるタンパク質の発現を測定します。 これには、c-kit/KITL や GDNF/Gfrα1 など、齧歯動物における SSC の自己再生/分化において重要であることが示されているタンパク質が含まれます。 また、インビトロ研究で説明したような形態および減数分裂マーカーの発現を調査することにより、精原段階を超えた生殖細胞のその後の分化を調査するために、移植片はより長期間維持される。 異種移植片を外因性性腺刺激ホルモン (LH/hCG +/- FSH) に曝露することによる精子形成の確立に対する影響も測定されます。 さらに、異種移植アプローチを使用して SSC を取得し、その後、これを増殖および/または精細管に移植してコロニー形成を達成することができます。

患者の追跡調査 患者は、エディンバラの RHCYP にある腫瘍学/内分泌学共同「晩期合併症」診療所に移送される際に定期的な監視画像検査が必要なくなるまで、腫瘍科診療所で通常どおり追跡調査されます。 患者は、成長と思春期の状態を監視するために、小児期から思春期にかけて3か月ごとに検査されます。 その後のフォローアップは月3回から年1回となります。 思春期は、タナー病期分類を使用した臨床検査と、ゴナドトロピン、テストステロン、およびインヒビン B の血中濃度を測定することによって評価されます。精巣容積はプラダー睾丸計を使用して測定され、精巣の成長を評価し、成長を監視するために毎年精巣の超音波検査が実行されます。生検の結果としての瘢痕または損傷。 重要な結果は、精巣生検を受けた男児における生殖腺不全（精子形成性と内分泌に分けられる）の有病率を、同様の診断を受けた男児やその他の診断を受けていない男児と比較したことである。 これにより、万が一生検による副作用があった場合でも確実に検出できるようになり、生検や精巣組織の凍結保存の選択基準を変更することも可能になります。