Prepubertaalisen kiveskudoksen kylmäsäilytys nuorten syöpää sairastavien poikien hedelmällisyyden säilyttämiseksi

Tavoitteet

1. Ensisijainen tavoite

   a) Kiveskudoksen kylmäsäilytys pre- ja peripuberteettisilta potilailta, jotka saavat mahdollisesti steriloivaa hoitoa tulevaa hoitoa varten hedelmällisyyden säilyttämiseksi.

   i. Sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerien kehittäminen/tarkentaminen ii. Potilaiden ja vanhempien asenteiden kartoittaminen tähän hedelmällisyyden säilyttämisen lähestymistapaan iii. Tarvittavan monialaisen ryhmän kehittäminen tätä varten

2. Toissijaiset tavoitteet

   1. Potilaiden seuranta kiveskudoksen kylmäsäilytyksen jälkeen
   2. Laboratoriotutkimus - kivesten sukusolujen kehittäminen hedelmällisyyden säilyttämiseksi i. Optimaalisten jäädytysmenetelmien kehittäminen kiveskudoksille ii. In vitro -viljelymenetelmät sukusolujen kypsymistä varten iii. Ksenograftointimenetelmien kehittäminen sukusolujen kypsymiseen

Suunnittelu Prospektiivinen kohorttitutkimus pre- ja peri-murrosikäisistä pojista

Tutkimuspopulaatio Pre- ja peripuberteetti pojat, jotka joutuvat joutumaan hoitoon, ja heillä on suuri riski myöhempään hedelmättömyyteen

Päätutkimuksen päätepiste Kiveskudoksen onnistunut pitkäaikainen kylmäsäilytys mahdollista tulevaa käyttöä hedelmällisyyden säilyttämisessä ja potilaiden seuranta kivesten biopsian vaikutusten varalta myöhempään endokriiniseen toimintaan

Laboratoriotekniikoiden kehittäminen kudosten pitkäaikaista varastointia tukevien menetelmien ja in vivo/in vitro spermatogeneesin menetelmien kehittämiseksi

menetelmät

Potilaiden rekrytointi Potilaat rekrytoidaan Edinburghin RHCYP:n onkologiaosastolta. Kelpoisille potilaille tarjotaan kivesten kylmäsäilytystä edellyttäen, että he täyttävät sisällyttämiskriteerit. Potilaille toimitetaan ikään sopivat potilastietolomakkeet.

Potilaan suostumus Suostumus koskee kiveskudoksen kylmäsäilytystä ja säilytystä. Potilailla on myös mahdollisuus sallia kudoksen käyttö tutkimustarkoituksiin, mutta tämän näkökohdan kieltäminen ei estä heitä suostumasta kudoksen kylmäsäilytykseen. Tutkimuspotilaiden nuoresta iästä ja kypsymättömyydestä johtuen kirjallinen tietoinen suostumus kivesten biopsiaan yleisanestesiassa hankitaan potilaan vanhemmilta/huoltajilta, ellei potilaiden katsota pystyvän antamaan täysin tietoista suostumusta itse. Potilaan suostumus pyydetään niiltä pojilta, jotka eivät ole päteviä antamaan kirjallista tietoon perustuvaa suostumusta nuoren ikänsä vuoksi.

Kirurginen toimenpide Kivesbiopsia tehdään RHCYP:n leikkaussalissa ennen syövän gonadotoksisen hoidon aloittamista. Tämä tulee mahdollisuuksien mukaan samaan aikaan suunnitellun rutiinitoimenpiteen kanssa, joka vaatii yleisanestesian, jotta vältetään lisäanestesian tarve, joten tämä ei aiheuta viivästyksiä hoidon aloittamiseen. Virusseulontaan otetaan verinäyte, joka on kudossäilytyksen edellytys. Verinäyte säilytetään, jotta Tissues Services ja HTA voivat ajan mittaan tehdä tartuntatautitestauksia.

Kivesten tilavuus arvioidaan silmämääräisellä tarkastuksella ja manuaalisella tunnustelulla leikkauksessa. Poistettavan kudoksen määrä on tyypillisesti noin 0,6-0,8 ml yhdestä kiveksestä eikä koskaan yli 50 % yhden kiveksen kokonaistilavuudesta. Toimenpide sisältää yksipuolisen avoimen kivesten biopsian kivespussin viillon kautta.

Koska hoitoa sytotoksisella hoidolla ei ole aloitettu ennen biopsiaa, infektioriski on minimaalinen. Potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia, verenvuoto ei todennäköisesti ole suuri ongelma, koska verihiutaleiden määrä ja toiminta ovat yleensä normaaleja näillä potilailla. Leukemiapotilailla trombosytopenia on todennäköisesti läsnä diagnoosin yhteydessä, mutta hemostaasi varmistetaan rutiininomaisesti verihiutaleiden siirrolla näiden potilaiden leikkaustoimenpiteitä varten.

Biopsia otetaan kiveskudoksen kylmäsäilytystä varten, ja osa näytteestä menee laboratoriotutkimukseen (jos suostumus on saatu tähän tarkoitukseen). Kokenut embryologi analysoi murrosikäisillä potilailla kylmäsäilytystä varten kudoksen välittömästi siittiöiden esiintymisen varalta standardimenetelmin. Jos siittiöitä on läsnä, osa näytteestä käytetään kivesten siittiöiden erottamiseen (TESE) ja varastointiin, kun taas jäljelle jäänyt kudos kylmäsäilytetään alla kuvatulla tavalla.

Kiveskudoksen kylmäsäilytys Kiveskudosta säilytetään HTA:n lisenssiehtojen mukaisesti. Näytteet kerätään steriiliin Hankin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgia) ja kuljetetaan Tissue Servicesille kryosäilytystä ja varastointia varten.

1. Kypsymättömän kiveskudoksen kylmäsäilytys ITT:n kylmäsäilytys suoritetaan asettamalla kaksi kudospalaa kuhunkin kryovialiin, joka sisältää 0,7 M DMSO:ta (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia) ja 0,1 M sakkaroosia (+S; 10274-5c; VWR, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven Belgia) ja 10 mg/ml HSA:ta, kuten aiemmin on kuvattu (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). Tasapainotus suoritetaan +4°C:ssa 30 min. Ohjelmoitavalla pakastimella pullot jäähdytetään nopeudella 1 °C/min pitäen 0 °C:ssa 5 minuuttia, minkä jälkeen jäähdytetään nopeudella 0,5 °C/min 20 °C:seen. Tässä lämpötilassa ohjelma pysäytetään 10 minuutiksi manuaalisen kylvön mahdollistamiseksi. Ohjelma jatkuu nopeudella 0,5 °C/min 240 °C:seen asti, pidetään 10 minuuttia ja jatkuu 270 °C:seen 7 °C/min, minkä jälkeen se upotetaan nestemäiseen typpeen.
2. Kypsän kiveskudoksen kylmäsäilytys Jokainen biopsia jauhetaan huolellisesti kahdella hienolla neulalla petrimaljassa, jossa on 2 ml HBSS:ää tai Human Tubule Fluidia täydennettynä 2,5 % HSA:lla (muokattu julkaisusta Verheyen, De Croo et ai. 1995). Kun kudos/solususpensiota on sentrifugoitu 500 g:llä 10 minuuttia ja supernatantti on poistettu, pelletti suspendoidaan uudelleen 200 ul:aan HBSS- tai Human Tubule Fluid -liuosta, jota on täydennetty 2,5 % HSA:lla. SpermFreeze (Vitrolife) (lisätään hitaasti suhteessa 1:1 (v/v) suspensioon. 20 minuutin tasapainottamisen jälkeen 37 °C:ssa siittiösuspensio imetään 500 ul:n kryosolkiin (IMV, l'Aigle Cedex, Ranska). Jäähdytys ja pakastus suoritetaan tietokoneohjauksella käyttäen standardiohjelmaa siemensyöksyille (Verheyen, Pletincx et ai. 1993). Pillit asetetaan ohjelmoitavan biologisen pakastimen kammioon ja jäähdytetään seuraavan ohjelman mukaisesti: (i) jäähdytysnopeus -1°C/min huoneenlämpötilasta 4°C:een (ii) pidetään 1 min (iii) pakastus nopeus -5 °C/min 4 °C:sta -80 °C:seen (iv) upota nestetyppeen (-196 °C).

Laboratoriotutkimus Tämän sovelluksen ensisijaisena tavoitteena on varastoida potilaiden kiveskudosta, jota voidaan tarvittaessa käyttää tulevaisuudessa hedelmällisyyden säilyttämiseen. Lupaa haetaan kuitenkin myös ylimääräisen kudososan käyttämiseen laboratoriotutkimuksiin. Edellä kuvatun kudoksen hankkimisen lisäksi tutkijat käyttävät myös kudoksia, jotka on saatu vaihtoehtoisesta kudoslähteestä, joka on saatu yhteistyökeskuksesta (John Radcliffe Hospital, Oxford, UK). Tämä toinen ihmisen prepubertaalisen kivesmateriaalin lähde säilytetään HTA-lisenssillä (viite: 11106), jossa on aiemmin saatu lupa kudoksen käyttöön hyväksytyssä tutkimuksessa, mukaan lukien eläintutkimukset.

Tätä kiveskudosta käytetään kolmeen pääasialliseen laboratoriotutkimukseen

1. Optimaaliset pakastusmenetelmät esipuberteettia edeltävälle kiveskudokselle ja -soluille

   Jäätymisolosuhteet on optimoitava ja parannettava ksenovapailla kliinisen laadun komponenteilla, ennen kuin kliinistä käyttöä voidaan harkita. Tutkijat arvioivat erilaisten kylmäsuoja-aineiden käyttöä sukusolujen eloonjäämis- ja kehityspotentiaaliin tutkimukseen otetun esimurrosiän kudoksen osassa. Sulatuksen jälkeinen elinkelpoisuus ja toiminnallisuus arvioidaan immunohistokemialla, virtaussytometrillä ja RT-PCR:llä. Kudoksen toiminnallisten ominaisuuksien arvioimiseksi jäädyttämisen jälkeen kudos siirretään tai sitä käytetään in vitro -viljelyyn.

2. Esipuberteetin kiveskudoksen in vitro -viljely

   Kiveskudoselinviljely pehmeällä agarjärjestelmällä on johtanut täydelliseen siittiöiden muodostumiseen vastasyntyneen hiiren kiveksellä (Sato, Katagiri et al. 2011). Tämä menetelmä mukautetaan käytettäväksi ihmisen esimurrosiän kiveskudoksen kanssa tutkimalla eri viljelyalustojen, seerumin ja gonadotropiinien/muiden kasvutekijöiden lisäämisen vaikutuksia sukusolujen erilaistumisen stimuloimiseksi. Tämä arvioidaan histologisella analyysillä ja spermatogoniamarkkerien ilmentymisellä (esim. MAGE-A4, Thy-1), spermatosyytit (esim. SCP-3, Prohibitin) ja spermatidit (esim. Protamiini-2, SP-10), joita tutkitaan erilaisilla menetelmillä, mukaan lukien qPCR, virtaussytometria ja proteiiniekspressio. Viljelyolosuhteiden modifikaatioita seuraavien aineiden lisäämisellä harkitaan: (1) Knock-out Serum Replacement (KO-SR), koska se indusoi täydellisen spermatogeneesin vastasyntyneen hiiren kivesten kudosviljelmässä (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) Retinoiinihappo, koska sillä on tunnettu rooli meioosissa ja spermatogeenisessa erilaistumisessa; (3) Testosteroni, koska korkeat testosteronipitoisuudet ovat välttämättömiä spermatogeneesille in vivo.

3. Ksenografointi

Kivesksenograftointi edustaa mallijärjestelmää, jolla tutkitaan tekijöitä, joita tarvitaan spermatogonaalisten kantasolujen (SSC) markkinaraon muodostamiseen (Mitchell, Saunders et al. 2010). Kiveskudos siirretään hiirille ektooppisesti (selän iho, kivespussi, munuaiskapseli) tai suoraan kivekseen SSC-poolin muodostamiseksi. Tutkijat selvittävät, mitkä tekijät ovat vastuussa SSC-alueen ylläpidosta käyttämällä vakiintuneita kehittyneitä immunohistokemiallisia yhteislokalisaatiotutkimuksia. Tutkijat määrittävät proteiinin ilmentymisen SSC:issä ja ympäröivässä markkinaraossa, mukaan lukien somaattiset solut, tyvikalvo ja verisuonisto. Tämä sisältää proteiineja, joiden on osoitettu olevan tärkeitä SSC:n itsensä uusiutumisessa/erilaistumisessa jyrsijöillä, kuten c-kit/KITL ja GDNF/Gfrα1. Siirteitä säilytetään myös pidempiä aikoja sukusolujen myöhemmän erilaistumisen tutkimiseksi spermatogoniaalisen vaiheen jälkeen tutkimalla meioottisten markkerien morfologiaa ja ilmentymistä, kuten on kuvattu in vitro -työssä. Lisäksi määritetään vaikutukset spermatogeneesin muodostumiseen, kun ksenograftit altistuvat eksogeenisille gonadotropiineille (LH/hCG +/- FSH). Lisäksi ksenograftilähestymistapaa käytetään SSC:iden saamiseksi, joita voidaan sitten lisätä ja/tai siirtää siementubuluksiin kolonisaation saavuttamiseksi.

Potilaiden seuranta Potilaita seurataan syöpäklinikalla normaalisti, kunnes heiltä ei enää vaadita säännöllistä seurantakuvausta, kun heidät siirretään Edinburghin RHCYP:n yhteiselle onkologian/endokrinologian "Late Effects" -klinikalle. Potilaat tarkistetaan 3 kuukauden välein lapsuuden ja murrosiän ajan kasvun ja murrosiän tilan seuraamiseksi. Seuraava seuranta on 3 kuukauden ja vuoden välillä. Murrosikä arvioidaan kliinisellä tutkimuksella Tanner Staging -menetelmällä ja myös mittaamalla gonadotropiinien, testosteronin ja inhibiini B:n pitoisuudet veressä. Kivesten tilavuudet mitataan Prader-orkidometrillä ja vuosittain suoritetaan kivesten ultraääni kivesten kasvun arvioimiseksi ja kivesten seuraamiseksi. arpia tai vaurioita biopsian seurauksena. Keskeinen tulos on sukurauhasten vajaatoiminnan esiintyvyys (jaettuna spermatogeeniseen ja endokriiniseen) pojilla, joille on otettu kivesbiopsia, verrattuna niihin, joilla on samanlainen tai muita diagnooseja, joilla ei ole. Tämä varmistaa, että se havaitaan siinä epätodennäköisessä tapauksessa, että biopsialla on haitallisia vaikutuksia, ja se mahdollistaa myös biopsian ja kiveskudoksen kylmäsäilytyksen valintakriteereiden muuttamisen.