Criopreservação de tecido testicular pré-púbere para preservação da fertilidade em meninos com câncer

Objetivos

1. Objetivo primário

   a) Criopreservação de tecido testicular de pacientes pré e peripúberes submetidos a terapia potencialmente esterilizante para uso terapêutico futuro para preservar a fertilidade.

   eu. Desenvolvimento/aperfeiçoamento de critérios de inclusão e exclusão ii. Exploração das atitudes dos pacientes e dos pais em relação a esta abordagem à preservação da fertilidade iii. Desenvolvimento do grupo multidisciplinar necessário para fornecer este

2. Objetivos Secundários

   1. Acompanhamento de pacientes após criopreservação de tecido testicular
   2. Pesquisa laboratorial – desenvolvimento de células germinativas testiculares para preservação da fertilidade i. Desenvolvimento de métodos de congelamento ideais para tecido testicular ii. Métodos de cultura in vitro para maturação de células germinativas iii. Desenvolvimento de abordagens de xenoenxerto para maturação de células germinativas

Desenho Estudo de coorte prospectivo de meninos pré e peripúberes

População do estudo Meninos pré e peripúberes que serão submetidos a terapia com alto risco de infertilidade subsequente

Ponto final do estudo principal Crioarmazenamento bem-sucedido de tecido testicular a longo prazo para potencial uso futuro na preservação da fertilidade e acompanhamento de pacientes quanto aos efeitos da biópsia testicular na função endócrina subsequente

Estabelecimento de técnicas laboratoriais para o desenvolvimento de métodos para apoiar o armazenamento a longo prazo de tecidos e métodos para espermatogênese in vivo/in vitro

Métodos

Recrutamento de pacientes Os pacientes serão recrutados no Departamento de Oncologia do RHCYP em Edimburgo. A criopreservação testicular será oferecida aos pacientes elegíveis, desde que atendam aos critérios de inclusão. Folhas de informações do paciente apropriadas à idade serão fornecidas aos pacientes.

Consentimento do Paciente O consentimento será para criopreservação e armazenamento de tecido testicular. Os pacientes também terão a opção de permitir a utilização de tecidos para fins de pesquisa, porém recusar esse aspecto não os impedirá de consentir com a criopreservação de tecidos. Devido à pouca idade e imaturidade dos pacientes do estudo, o consentimento informado por escrito para uma biópsia testicular sob anestesia geral será obtido dos pais/responsáveis ​​do paciente, a menos que os próprios pacientes sejam considerados capazes de dar consentimento totalmente informado. O consentimento do paciente será solicitado aos meninos não considerados competentes para fornecer consentimento informado por escrito devido à sua tenra idade.

Procedimento Cirúrgico A biópsia testicular será realizada nas salas de cirurgia do RHCYP antes do início do tratamento gonadotóxico do câncer. Isto coincidirá, sempre que possível, com um procedimento de rotina planeado que requer anestesia geral, a fim de evitar a necessidade de anestesia adicional, pelo que não resultará num atraso no início do tratamento. Uma amostra de sangue será coletada para triagem viral, que é um requisito para armazenamento de tecidos. A amostra de sangue será armazenada para permitir testes adicionais para doenças infecciosas, conforme exigido ao longo do tempo pelos Serviços de Tecidos e pela HTA.

O volume testicular será avaliado por inspeção visual e palpação manual no momento da cirurgia. A quantidade de tecido removido será normalmente de aproximadamente 0,6-0,8 ml de um testículo, e nunca mais de 50% do volume total de um único testículo. O procedimento envolverá uma biópsia testicular aberta unilateral através de uma incisão escrotal.

Como o tratamento com terapia citotóxica não será iniciado antes da biópsia, o risco de infecção é mínimo. Em pacientes com tumores sólidos, é improvável que o sangramento seja um problema grave, uma vez que o número e a função plaquetária são geralmente normais nesses pacientes. Em pacientes com leucemia, é provável que a trombocitopenia esteja presente no momento do diagnóstico, mas a hemostasia é rotineiramente garantida por transfusão de plaquetas para procedimentos cirúrgicos nesses pacientes.

A biópsia será realizada para criopreservação do tecido testicular, sendo uma parte da amostra destinada à pesquisa laboratorial (caso tenha sido obtido consentimento para esse fim). Em pacientes na puberdade, o tecido para criopreservação será imediatamente analisado por um embriologista experiente quanto à presença de espermatozóides, utilizando métodos padrão. Se houver espermatozoides presentes, uma parte da amostra será usada para extração e armazenamento de esperma testicular (TESE), enquanto o tecido restante será criopreservado usando os métodos descritos abaixo.

Criopreservação de tecido testicular O tecido testicular será armazenado sob os termos de licença da HTA. As amostras são coletadas em solução salina balanceada estéril de Hank (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Bélgica) e transportadas para Tissue Services para criopreservação e armazenamento.

1. Criopreservação de tecido testicular imaturo A criopreservação de ITT é realizada colocando dois pedaços de tecido em cada frasco criogênico contendo DMSO 0,7 M (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica), com sacarose 0,1 M (+S; 10274-5c; VWR, Leuven, Bélgica) e 10 mg/ml de HSA conforme descrito anteriormente (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). O equilíbrio é realizado a +4°C durante 30 min. Utilizando um congelador programável, os frascos são arrefecidos a 1°C/min com manutenção a 0°C durante 5 min, seguido de arrefecimento a 0,5°C/min até 20°C. A esta temperatura, o programa é suspenso por 10 minutos para permitir a semeadura manual. O programa continua a uma taxa de 0,5°C/min até 240°C, mantido por 10 min, e continua até 270°C a 7°C/min, com subsequente imersão em nitrogênio líquido.
2. Criopreservação de tecido testicular maduro Cada biópsia é picada cuidadosamente com duas agulhas finas em uma placa de Petri com 2 mL de HBSS ou Fluido Túbulo Humano, suplementado com 2,5% de HSA (adaptado de Verheyen, De Croo et al. 1995). Após centrifugação da suspensão de tecido/célula a 500 g durante 10 min e remoção do sobrenadante, o sedimento é ressuspenso em 200 µL de HBSS ou Fluido Túbulo Humano, suplementado com 2,5% de HSA. SpermFreeze (Vitrolife) (é adicionado lentamente na proporção de 1:1 (v/v) à suspensão. Após 20 min de equilíbrio a 37°C, a suspensão de esperma é aspirada para uma criostraw de 500 µL (IMV, l'Aigle Cedex, França). O resfriamento e o congelamento são realizados sob controle de computador usando um programa padrão para espermatozóides ejaculados (Verheyen, Pletincx et al. 1993). Os canudos são colocados na câmara de um freezer biológico programável e resfriados de acordo com o seguinte programa: (i) taxa de resfriamento de -1°C/min da temperatura ambiente até 4°C (ii) manutenção por 1 min (iii) congelamento taxa de -5°C/min de 4°C a -80°C (iv) mergulhar em nitrogênio líquido (-196°C).

Pesquisa laboratorial O objetivo principal desta aplicação é armazenar tecido testicular de pacientes que possa ser usado no futuro para preservação da fertilidade, se necessário. No entanto, também será solicitado consentimento para o uso de uma porção extra de tecido para pesquisas laboratoriais. Além de obter tecido conforme descrito acima, os investigadores também usarão tecidos obtidos de uma fonte alternativa de tecido obtido em um centro colaborador (John Radcliffe Hospital, Oxford, Reino Unido). Esta segunda fonte de material testicular pré-puberal humano será armazenada sob uma licença HTA (referência: 11106) na qual o consentimento foi previamente obtido para o uso do tecido em pesquisas aprovadas, incluindo pesquisas com animais.

Este tecido testicular será usado em três aspectos principais da pesquisa laboratorial

1. Métodos de congelamento ideais para tecidos e células testiculares pré-púberes

   As condições de congelamento precisam ser otimizadas e melhoradas com componentes de grau clínico isentos de xeno antes que a aplicação clínica possa ser considerada. Os investigadores avaliarão o uso de vários crioprotetores na sobrevivência e no potencial de desenvolvimento de células germinativas na porção do tecido pré-púbere levado para pesquisa. A viabilidade e funcionalidade pós-descongelamento serão avaliadas por imunohistoquímica, citometria de fluxo e RT-PCR. Para avaliar as propriedades funcionais do tecido após o congelamento, o tecido será xenoenxertado ou utilizado para cultura in vitro.

2. Cultura in vitro de tecido testicular pré-púbere

   A cultura de órgãos de tecido testicular usando um sistema de ágar mole resultou na espermatogênese completa usando testículos de camundongos neonatos (Sato, Katagiri et al. 2011). Este método será adaptado para uso com tecido testicular pré-púbere humano, investigando os efeitos de diferentes meios de cultura, soro e adição de gonadotrofinas/outros fatores de crescimento para estimular a diferenciação de células germinativas. Isto será avaliado por análise histológica e expressão de marcadores para espermatogônias (ex. MAGE-A4, Thy-1), espermatócitos (por exemplo SCP-3, Proibitina) e espermátides (por exemplo Protamina-2, SP-10) que serão estudados com diferentes metodologias, incluindo qPCR, citometria de fluxo e expressão proteica. Serão consideradas modificações nas condições de cultura adicionando as seguintes substâncias: (1) Knock-out Serum Replacement (KO-SR), pois induziu espermatogênese completa em cultura de tecido testicular de camundongos neonatos (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) Ácido retinóico, pois tem um papel conhecido na meiose e na diferenciação espermatogênica; (3) A testosterona, pois altas concentrações de testosterona são essenciais para a espermatogênese in vivo.

3. Xenoenxerto

O xenoenxerto testicular representa um sistema modelo para investigar os fatores necessários para estabelecer o nicho de células-tronco espermatogoniais (SSC) (Mitchell, Saunders et al. 2010). O tecido testicular será xenoenxertado em camundongos, ectopicamente (pele dorsal, escrotal, cápsula renal) ou diretamente no testículo, a fim de estabelecer o pool de SSC. Os investigadores examinarão quais fatores são responsáveis ​​​​pela manutenção do nicho SSC usando estudos avançados de co-localização imuno-histoquímica estabelecidos. Os investigadores determinarão a expressão proteica nos SSCs e no nicho circundante, incluindo células somáticas, lâmina basal e vasculatura. Isto incluirá proteínas que demonstraram ser importantes na auto-renovação/diferenciação do SSC em roedores, como c-kit/KITL e GDNF/Gfrα1. Os enxertos também serão mantidos por períodos mais longos, a fim de investigar a diferenciação subsequente das células germinativas além do estágio espermatogonial, investigando a morfologia e a expressão de marcadores meióticos, como descrito para trabalho in vitro. Os efeitos no estabelecimento da espermatogênese pela exposição de xenoenxertos a gonadotrofinas exógenas (LH/hCG +/- FSH) também serão determinados. Além disso, a abordagem de xenoenxerto será utilizada para obter SSCs que podem então ser propagadas e/ou transplantadas em túbulos seminíferos para alcançar a colonização.

Acompanhamento de pacientes Os pacientes serão acompanhados na clínica de Oncologia normalmente até que não sejam mais necessários exames de imagem de vigilância regulares, quando serão transferidos para a clínica conjunta de Oncologia/Endocrinologia 'Efeitos Tardios' no RHCYP em Edimburgo. Os pacientes serão avaliados a cada 3 meses durante a infância e a puberdade para monitorar o crescimento e o estado puberal. O acompanhamento subsequente será entre 3 meses e anualmente. A puberdade será avaliada por exame clínico usando o Estadiamento de Tanner e também pela medição dos níveis sanguíneos de gonadotrofinas, testosterona e Inibina B. Os volumes testiculares serão medidos usando um orquidômetro Prader e uma ultrassonografia anual dos testículos será realizada para avaliar o crescimento testicular e monitorar para cicatrizes ou danos como resultado da biópsia. Um resultado chave é a prevalência de insuficiência gonadal (dividida em espermatogênica e endócrina) em meninos que fizeram biópsias testiculares em comparação com aqueles com diagnósticos semelhantes e outros que não o fizeram. Isto garantirá que, no caso improvável de ocorrerem efeitos adversos da biópsia, estes serão detectados e também permitirá a modificação dos critérios de seleção para biópsia e criopreservação de tecido testicular.