Kryokonzervace prepubertální testikulární tkáně pro zachování plodnosti u mladých chlapců s rakovinou

Cíle

1. Primární cíl

   a) Kryokonzervace testikulární tkáně od prepubertálních a peripubertálních pacientů podstupujících potenciálně sterilizační terapii pro budoucí terapeutické použití k zachování plodnosti.

   i. Vývoj/zpřesnění kritérií pro zařazení a vyloučení ii. Zkoumání postojů pacientů a rodičů k tomuto přístupu k zachování plodnosti iii. Rozvoj požadované multidisciplinární skupiny, která to zajistí

2. Sekundární cíle

   1. Sledování pacientů po kryokonzervaci tkáně varlat
   2. Laboratorní výzkum - vývoj zárodečných buněk varlat pro zachování plodnosti i. Vývoj optimálních metod zmrazování pro tkáň varlat ii. In-vitro kultivační metody pro zrání zárodečných buněk iii. Vývoj xenograftových přístupů pro zrání zárodečných buněk

Design Prospektivní kohortová studie pre- a peri-pubertálních chlapců

Studie Populace Prepubertální a peripubertální chlapci podstupující terapii s vysokým rizikem následné neplodnosti

Hlavní cíl studie Úspěšné dlouhodobé kryoskladování testikulární tkáně pro potenciální budoucí použití při zachování plodnosti a sledování pacientů kvůli účinkům testikulární biopsie na následnou endokrinní funkci

Zavedení laboratorních technik pro vývoj metod na podporu dlouhodobého skladování tkáně a metod pro spermatogenezi in vivo/in vitro

Metody

Nábor pacientů Pacienti budou rekrutováni z onkologického oddělení RHCYP v Edinburghu. Kryokonzervace varlat bude nabídnuta způsobilým pacientům za předpokladu, že splňují kritéria pro zařazení. Pacientům budou poskytnuty informační listy odpovídající věku pacientů.

Souhlas pacienta Souhlas se bude týkat kryokonzervace a skladování tkáně varlat. Pacienti budou mít také možnost povolit použití tkáně pro výzkumné účely, avšak odmítnutí tohoto aspektu jim nezabrání v souhlasu s kryokonzervací tkáně. Vzhledem k nízkému věku a nezralosti pacientů ve studii bude od rodičů/opatrovníka pacienta získán písemný informovaný souhlas s testikulární biopsií v celkové anestezii, pokud pacienti nejsou považováni za schopné dát plně informovaný souhlas sami. Souhlas pacienta bude požadován od těch chlapců, kteří nejsou považováni za způsobilé poskytnout písemný informovaný souhlas vzhledem k jejich nízkému věku.

Chirurgický postup Testikulární biopsie bude probíhat na operačních sálech v RHCYP před zahájením gonadotoxické léčby rakoviny. To se bude, kdykoli to bude možné, shodovat s plánovaným rutinním postupem vyžadujícím celkovou anestezii, aby se předešlo nutnosti další anestezie, takže to nebude mít za následek zpoždění zahájení léčby. Bude odebrán vzorek krve pro virový screening, který je podmínkou pro skladování tkáně. Vzorek krve bude uložen, aby bylo možné provést další testování na infekční onemocnění, jak to bude časem vyžadovat tkáňové služby a HTA.

Objem varlat bude posouzen vizuální kontrolou a ruční palpací při operaci. Množství odebrané tkáně bude typicky přibližně 0,6-0,8 ml z jednoho varlete a nikdy nepřesahující 50 % celkového objemu jednoho varlete. Výkon bude zahrnovat jednostrannou otevřenou testikulární biopsii řezem šourku.

Protože léčba cytotoxickou terapií nezačne před biopsií, riziko infekce je minimální. U pacientů se solidními nádory je nepravděpodobné, že by krvácení představovalo velký problém, protože počet krevních destiček a funkce jsou u těchto pacientů obecně normální. U pacientů s leukémií je při diagnóze pravděpodobně přítomna trombocytopenie, ale u těchto pacientů je při operačních výkonech běžně zajištěna hemostáza transfuzí krevních destiček.

Biopsie bude odebrána za účelem kryokonzervace tkáně varlat, přičemž část vzorku půjde na laboratorní výzkum (pokud byl k tomuto účelu získán souhlas). U pacientů v pubertě bude tkáň pro kryoprezervaci okamžitě analyzována zkušeným embryologem na přítomnost spermatu pomocí standardních metod. Pokud jsou přítomny spermie, bude část vzorku použita pro extrakci testikulárních spermií (TESE) a skladování, zatímco zbývající tkáň bude kryokonzervována pomocí metod popsaných níže.

Kryokonzervace testikulární tkáně Tkáň varlat bude skladována podle licenčních podmínek HTA. Vzorky se odebírají do sterilního Hankova vyváženého fyziologického roztoku (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgie) a přepravují se do Tissue Services pro kryokonzervaci a skladování.

1. Kryokonzervace nezralé testikulární tkáně Kryoprezervace ITT se provádí umístěním dvou kousků tkáně do každé kryozkumavky obsahující 0,7 M DMSO (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgie), s 0,1 M sacharózou (+S; 10274-5c; VWR, Leuven, Leuven, Leuven Belgie) a 10 mg/ml HSA, jak bylo popsáno dříve (Keros, Hultenby a kol. 2007) (Wyns, Curaba a kol. 2007). Ekvilibrace se provádí při +4 °C po dobu 30 minut. Pomocí programovatelného mrazáku se lahvičky chladí rychlostí 1 °C/min s udržováním na 0 °C po dobu 5 minut, následuje chlazení rychlostí 0,5 °C/min na 20 °C. Při této teplotě se program na 10 minut pozastaví, aby se umožnilo ruční setí. Program pokračuje rychlostí 0,5 °C/min až do 240 °C, udržuje se 10 minut a pokračuje do 270 °C rychlostí 7 °C/min, s následným ponořením do kapalného dusíku.
2. Kryokonzervace zralé testikulární tkáně Každá biopsie se opatrně rozemele dvěma jemnými jehlami v Petriho misce s 2 ml HBSS nebo tekutiny z lidských tubulů, doplněné 2,5 % HSA (upraveno podle Verheyen, De Croo et al. 1995). Po odstředění suspenze tkáň/buňka při 500 g po dobu 10 minut a odstranění supernatantu se peleta resuspenduje ve 200 ul HBSS nebo Human Tubule Fluid, doplněném 2,5 % HSA. SpermFreeze (Vitrolife) (přidává se pomalu v poměru 1:1 (obj./obj.) k suspenzi. Po 20 minutách ekvilibrace při 37 °C se suspenze spermatu odsaje do 500 ul kryostrálky (IMV, l'Aigle Cedex, Francie). Chlazení a zmrazení se provádí pod kontrolou počítače za použití standardního programu pro ejakulovaná spermie (Verheyen, Pletincx et al. 1993). Brčka se umístí do komory programovatelného biologického mrazáku a ochladí se podle následujícího programu: (i) rychlost chlazení -1 °C/min z pokojové teploty na 4 °C (ii) držení po dobu 1 minuty (iii) zmrazení rychlost -5 °C/min od 4 °C do -80 °C (iv) ponořit do kapalného dusíku (-196 °C).

Laboratorní výzkum Primárním cílem této aplikace je uchování tkáně varlat od pacientů, která může být v budoucnu v případě potřeby použita pro zachování plodnosti. Souhlas se však bude vyžadovat také pro použití zvláštní části tkáně pro laboratorní výzkum. Kromě získání tkáně, jak je popsáno výše, budou výzkumníci také používat tkáně získané z alternativního zdroje tkáně získané ze spolupracujícího centra (John Radcliffe Hospital, Oxford, UK). Tento druhý zdroj materiálu z lidských prepubertálních varlat bude uchováván pod licencí HTA (referenční číslo: 11106), ve které byl již dříve získán souhlas s použitím tkáně ve schváleném výzkumu, včetně výzkumu na zvířatech.

Tato tkáň varlat bude použita pro tři hlavní aspekty laboratorního výzkumu

1. Optimální metody zmrazování pro prepubertální tkáň a buňky varlat

   Před zvážením klinické aplikace je třeba optimalizovat a zlepšit podmínky zmrazování pomocí komponent klinické kvality bez obsahu xeno. Výzkumníci posoudí použití různých kryoprotektantů na přežití a vývojový potenciál zárodečných buněk v části prepubertální tkáně odebrané pro výzkum. Životaschopnost a funkčnost po rozmrazení budou hodnoceny imunohistochemicky, průtokovou cytometrií a RT-PCR. Pro vyhodnocení funkčních vlastností tkáně po zmrazení bude tkáň xenograftována nebo použita pro kultivaci in vitro.

2. In-vitro kultivace prepubertální tkáně varlat

   Kultivace tkáňových orgánů varlat pomocí systému měkkého agaru vedla k plné spermatogenezi pomocí varlat neonatálních myší (Sato, Katagiri et al. 2011). Tato metoda bude přizpůsobena pro použití s ​​tkání lidských prepubertálních varlat zkoumáním účinků různých kultivačních médií, séra a přidání gonadotropinů/jiných růstových faktorů ke stimulaci diferenciace zárodečných buněk. To bude hodnoceno histologickou analýzou a expresí markerů pro spermatogonii (např. MAGE-A4, Thy-1), spermatocyty (např. SCP-3, Prohibitin) a spermatidy (např. Protamin-2, SP-10), které budou studovány různými metodikami, včetně qPCR, průtokové cytometrie a proteinové exprese. Budou zváženy úpravy kultivačních podmínek přidáním následujících látek: (1) Knock-out Serum Replacement (KO-SR), protože indukuje kompletní spermatogenezi v kultuře varlat neonatálních myší (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) Kyselina retinová, protože má známou roli v meióze a spermatogenní diferenciaci; (3) Testosteron, protože vysoké koncentrace testosteronu jsou nezbytné pro spermatogenezi in vivo.

3. Xenotransplantace

Xenoštěpování varlat představuje modelový systém pro zkoumání faktorů potřebných k vytvoření niky spermatogoniálních kmenových buněk (SSC) (Mitchell, Saunders et al. 2010). Tkáň varlat bude myším xenoimplantována, ektopicky (dorzální kůže, šourek, ledvinové pouzdro) nebo přímo do varlat, aby se vytvořil SSC pool. Vyšetřovatelé budou zkoumat, které faktory jsou zodpovědné za udržení niky SSC pomocí zavedených pokročilých imunohistochemických studií společné lokalizace. Výzkumníci určí expresi proteinu v SSC a okolním výklenku, včetně somatických buněk, bazální laminy a vaskulatury. To bude zahrnovat proteiny, u kterých se ukázalo, že jsou důležité při sebeobnovení/diferenciaci SSC u hlodavců, jako je c-kit/KITL a GDNF/Gfrα1. Štěpy budou také udržovány po delší období, aby se prozkoumala následná diferenciace zárodečných buněk za spermatogoniálním stádiem zkoumáním morfologie a exprese meiotických markerů, jak je popsáno pro práci in vitro. Budou také stanoveny účinky na ustavení spermatogeneze vystavením xenograftů exogenním gonadotropinům (LH/hCG +/- FSH). Kromě toho bude k získání SSC použit přístup xenoimplantátů, které pak mohou být množeny a/nebo transplantovány do semenotvorných tubulů, aby se dosáhlo kolonizace.

Sledování pacientů Pacienti budou sledováni na onkologické klinice jako obvykle, dokud již nebudou povinni podstupovat pravidelné sledování, kdy budou převezeni na společnou onkologicko-endokrinologickou kliniku „Late Effects“ na RHCYP v Edinburghu. Pacienti budou vyšetřováni každé 3 měsíce během dětství a puberty, aby se sledoval růst a pubertální stav. Následné sledování bude mezi 3 měsíčními a ročními. Puberta bude hodnocena klinickým vyšetřením pomocí Tanner Staging a také měřením krevních hladin gonadotropinů, testosteronu a Inhibinu B. Testikulární objemy budou měřeny pomocí Prader orchidometru a bude prováděn každoroční ultrazvuk varlat pro posouzení růstu varlat a sledování. zjizvení nebo poškození v důsledku biopsie. Klíčovým výstupem je prevalence gonadálního selhání (rozděleného na spermatogenní a endokrinní) u chlapců, kteří podstoupili testikulární biopsii, ve srovnání s těmi s podobnou a jinou diagnózou, kteří ji neprovedli. To zajistí, že v nepravděpodobném případě, že dojde k nepříznivým účinkům biopsie, to bude detekováno a také to umožní úpravu výběrových kritérií pro biopsii a kryokonzervaci tkáně varlat.