Kriokonserwacja tkanki jąder przed okresem dojrzewania w celu zachowania płodności u młodych chłopców chorych na raka

Cele

1. Podstawowy cel

   a) Kriokonserwacja tkanki jąder od pacjentów w okresie przed i w okresie dojrzewania poddawanych terapii potencjalnie sterylizującej do przyszłego zastosowania terapeutycznego w celu zachowania płodności.

   I. Opracowanie/udoskonalenie kryteriów włączenia i wyłączenia ii. Badanie postaw pacjentów i rodziców wobec takiego podejścia do zachowania płodności iii. Stworzenie wymaganej grupy multidyscyplinarnej, która to zapewni

2. Cele drugorzędne

   1. Obserwacja pacjentów po kriokonserwacji tkanki jądra
   2. Badania laboratoryjne - rozwój komórek zarodkowych jąder w celu zachowania płodności, tj. Opracowanie optymalnych metod zamrażania tkanki jąder ii. Metody hodowli in vitro w celu dojrzewania komórek rozrodczych iii. Rozwój metod ksenoprzeszczepów w celu dojrzewania komórek rozrodczych

Projekt Prospektywne badanie kohortowe chłopców w okresie przed i w okresie dojrzewania

Badanie Populacja Chłopcy w okresie przed i w okresie dojrzewania, którzy mają zostać poddani terapii, obarczeni wysokim ryzykiem późniejszej niepłodności

Główny punkt końcowy badania Skuteczne, długoterminowe krioprzechowywanie tkanki jądra do potencjalnego przyszłego wykorzystania w celu zachowania płodności oraz obserwacja pacjentów pod kątem wpływu biopsji jądra na późniejszą czynność hormonalną

Opracowanie technik laboratoryjnych w celu opracowania metod wspomagania długotrwałego przechowywania tkanek oraz metod spermatogenezy in vivo/in vitro

Metody

Rekrutacja pacjentów Pacjenci będą rekrutowani na Oddziale Onkologii RHCYP w Edynburgu. Kriokonserwacja jąder będzie oferowana kwalifikującym się pacjentom, pod warunkiem że spełniają kryteria włączenia. Pacjentom zostaną dostarczone arkusze informacyjne dostosowane do wieku pacjenta.

Zgoda pacjenta Zgoda będzie dotyczyć kriokonserwacji i przechowywania tkanki jądra. Pacjenci będą mieli także możliwość wyrażenia zgody na wykorzystanie tkanki do celów badawczych, jednakże odmowa tej opcji nie uniemożliwi im wyrażenia zgody na kriokonserwację tkanki. Ze względu na młody wiek i niedojrzałość pacjentek, pisemna świadoma zgoda na biopsję jądra w znieczuleniu ogólnym zostanie uzyskana od rodziców/opiekunów pacjenta, chyba że uzna się, że pacjent jest w stanie samodzielnie wyrazić w pełni świadomą zgodę. Zgoda pacjentów będzie wymagana od chłopców, którzy ze względu na młody wiek nie zostaną uznani za kompetentnych do wyrażenia pisemnej świadomej zgody.

Procedura chirurgiczna Biopsja jądra zostanie przeprowadzona na salach operacyjnych w RHCYP przed rozpoczęciem leczenia gonadotoksycznego raka. Będzie to, jeśli to możliwe, zbiegać się z planowanym rutynowym zabiegiem wymagającym znieczulenia ogólnego, aby uniknąć konieczności stosowania dodatkowego znieczulenia, dlatego nie spowoduje opóźnienia w rozpoczęciu leczenia. Zostanie pobrana próbka krwi do badania przesiewowego w kierunku wirusów, co jest wymogiem w przypadku przechowywania tkanek. Próbka krwi będzie przechowywana w celu umożliwienia dalszych badań pod kątem chorób zakaźnych, zgodnie z wymaganiami Służby Tkanek i HTA.

Objętość jąder będzie oceniana na podstawie oględzin i ręcznego badania palpacyjnego podczas operacji. Ilość usuniętej tkanki będzie zazwyczaj wynosić około 0,6–0,8 ml z jednego jądra i nigdy nie więcej niż 50% całkowitej objętości pojedynczego jądra. Procedura polega na jednostronnej otwartej biopsji jądra przez nacięcie moszny.

Ponieważ leczenie cytotoksyczne nie zostanie rozpoczęte przed biopsją, ryzyko infekcji jest minimalne. Jest mało prawdopodobne, aby krwawienie u pacjentów z guzami litymi stanowiło poważny problem, ponieważ liczba i czynność płytek krwi są u nich na ogół prawidłowe. U pacjentów z białaczką w chwili rozpoznania prawdopodobnie występuje małopłytkowość, ale u tych pacjentów hemostazę rutynowo zabezpiecza się poprzez transfuzję płytek krwi podczas zabiegów operacyjnych.

Biopsja zostanie pobrana w celu kriokonserwacji tkanki jądra, a część próbki zostanie przeznaczona do badań laboratoryjnych (jeśli zostanie na to uzyskana zgoda). U pacjentów w okresie dojrzewania tkanka przeznaczona do kriokonserwacji zostanie natychmiastowo zbadana przez doświadczonego embriologa na obecność plemników standardowymi metodami. Jeżeli obecne są plemniki, część próbki zostanie wykorzystana do ekstrakcji plemników jąder (TESE) i przechowywania, natomiast pozostała tkanka zostanie kriokonserwowana przy użyciu metod opisanych poniżej.

Kriokonserwacja tkanki jądra Tkanka jądra będzie przechowywana zgodnie z warunkami licencji HTA. Próbki pobiera się do sterylnego, zrównoważonego roztworu soli Hanka (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgia) i transportuje do Tissue Services w celu kriokonserwacji i przechowywania.

1. Kriokonserwacja niedojrzałej tkanki jądra Kriokonserwację ITT przeprowadza się poprzez umieszczenie dwóch kawałków tkanki w każdej kriofiolce zawierającej 0,7 M DMSO (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia) z 0,1 M sacharozą (+S; 10274-5c; VWR, Leuven, Belgia) i 10 mg/ ml HSA, jak opisano wcześniej (Keros, Hultenby i in. 2007) (Wyns, Curaba i in. 2007). Równoważenie przeprowadza się w temperaturze +4°C przez 30 minut. Stosując programowalną zamrażarkę, fiolki schładza się z szybkością 1°C/min, utrzymując temperaturę 0°C przez 5 minut, a następnie schładza się z szybkością 0,5°C/min do 20°C. W tej temperaturze program zostaje wstrzymany na 10 minut, aby umożliwić ręczny wysiew. Program jest kontynuowany z szybkością 0,5°C/min do 240°C, utrzymywany przez 10 minut i kontynuowany do 270°C przy 7°C/min, z późniejszym zanurzeniem w ciekłym azocie.
2. Kriokonserwacja dojrzałej tkanki jądra Każdą biopsję ostrożnie rozdrabnia się dwiema cienkimi igłami na szalce Petriego z 2 ml HBSS lub płynu z ludzkich kanalików, uzupełnionego 2,5% HSA (na podstawie Verheyen, De Croo i wsp. 1995). Po odwirowaniu zawiesiny tkanki/komórki przy 500 g przez 10 minut i usunięciu supernatantu, osad ponownie zawiesza się w 200 µl HBSS lub płynu z ludzkich kanalików, uzupełnionego 2,5% HSA. SpermFreeze (Vitrolife) (dodaje się powoli w stosunku 1:1 (v/v) do zawiesiny. Po 20 minutach równoważenia w temperaturze 37°C, zawiesinę plemników aspiruje się do 500 µl kriotrawki (IMV, l'Aigle Cedex, Francja). Chłodzenie i zamrażanie przeprowadza się pod kontrolą komputera, stosując standardowy program dla plemników z wytryskiem (Verheyen, Pletincx i wsp. 1993). Słomki umieszcza się w komorze programowalnej zamrażarki biologicznej i schładza według następującego programu: (i) szybkość chłodzenia -1°C/min od temperatury pokojowej do 4°C (ii) przetrzymywanie 1 min (iii) zamrażanie szybkość -5°C/min od 4°C do -80°C (iv) zanurzyć się w ciekłym azocie (-196°C).

Badania laboratoryjne Głównym celem tej aplikacji jest przechowywanie tkanki jąder od pacjentów, która w razie potrzeby może zostać wykorzystana w przyszłości w celu zachowania płodności. Wymagana będzie jednak również zgoda na wykorzystanie dodatkowej porcji tkanki do badań laboratoryjnych. Oprócz uzyskania tkanki w sposób opisany powyżej badacze wykorzystają również tkanki uzyskane z alternatywnego źródła tkanki uzyskanej ze współpracującego ośrodka (szpital John Radcliffe w Oksfordzie, Wielka Brytania). To drugie źródło materiału ludzkiego jądra z okresu przed okresem dojrzewania będzie przechowywane na podstawie licencji HTA (nr referencyjny: 11106), na mocy której uzyskano wcześniej zgodę na wykorzystanie tej tkanki w zatwierdzonych badaniach, w tym badaniach na zwierzętach.

Tkanka jądra zostanie wykorzystana w trzech głównych aspektach badań laboratoryjnych

1. Optymalne metody zamrażania tkanek i komórek jądra przed okresem dojrzewania

   Zanim będzie można rozważyć zastosowanie kliniczne, należy zoptymalizować i ulepszyć warunki zamrażania za pomocą niezawierających kseno składników klasy klinicznej. Badacze ocenią wpływ różnych krioprotektantów na przeżycie i potencjał rozwojowy komórek rozrodczych w obrębie pobranej do badań części tkanki przed okresem dojrzewania. Żywotność i funkcjonalność po rozmrożeniu zostaną ocenione za pomocą immunohistochemii, cytometrii przepływowej i RT-PCR. Aby ocenić właściwości funkcjonalne tkanki po zamrożeniu, tkanka zostanie przeszczepiona ksenoprzeszczepem lub wykorzystana do hodowli in vitro.

2. Kultura in vitro tkanki jądra przed okresem dojrzewania

   Hodowla narządów tkankowych jąder przy użyciu układu miękkiego agaru doprowadziła do pełnej spermatogenezy przy użyciu jąder noworodków myszy (Sato, Katagiri i in. 2011). Metoda ta zostanie przystosowana do stosowania z ludzką tkanką jądra w okresie przed okresem dojrzewania poprzez badanie wpływu różnych pożywek hodowlanych, surowicy i dodatku gonadotropin/innych czynników wzrostu w celu stymulacji różnicowania komórek rozrodczych. Zostanie to ocenione na podstawie analizy histologicznej i ekspresji markerów spermatogonii (np. MAGE-A4, Thy-1), spermatocyty (np. SCP-3, Prohibitin) i plemniki (np. Protamina-2, SP-10), które będą badane przy użyciu różnych metodologii, w tym qPCR, cytometrii przepływowej i ekspresji białek. Rozważona zostanie modyfikacja warunków hodowli poprzez dodanie następujących substancji: (1) wymiana surowicy typu „knock-out” (KO-SR), ponieważ indukuje całkowitą spermatogenezę w hodowli tkanki jądra noworodków myszy (Sato, Katagiri i in. 2011); (2) Kwas retinowy, ponieważ odgrywa znaną rolę w mejozie i różnicowaniu spermatogennym; (3) Testosteron, ponieważ wysokie stężenia testosteronu są niezbędne do spermatogenezy in vivo.

3. Ksenoprzeszczep

Ksenoprzeszczep jądra stanowi system modelowy do badania czynników wymaganych do ustalenia niszy plemnikowych komórek macierzystych (SSC) (Mitchell, Saunders i in. 2010). Tkanka jądra zostanie ksenoprzeszczepiona myszom, ektopowo (skóra grzbietu, moszna, torebka nerkowa) lub bezpośrednio do jądra w celu ustalenia puli SSC. Badacze zbadają, które czynniki są odpowiedzialne za utrzymanie niszy SSC, korzystając z ustalonych zaawansowanych badań kolokalizacji immunohistochemicznej. Badacze określą ekspresję białek w SSC i otaczającej je niszy, w tym komórkach somatycznych, blaszce podstawnej i układzie naczyniowym. Będzie to obejmować białka, które, jak wykazano, są ważne w samoodnawianiu/różnicowaniu SSC u gryzoni, takie jak c-kit/KITL i GDNF/Gfrα1. Przeszczepy będą również przechowywane przez dłuższe okresy w celu zbadania późniejszego różnicowania komórek rozrodczych poza stadium plemnikowe poprzez badanie morfologii i ekspresji markerów mejotycznych, takich jak opisano dla prac in vitro. Określony zostanie także wpływ na zapoczątkowanie spermatogenezy poprzez narażenie ksenoprzeszczepów na egzogenne gonadotropiny (LH/hCG +/- FSH). Ponadto metoda ksenoprzeszczepu zostanie zastosowana w celu uzyskania SSC, które można następnie rozmnażać i/lub przeszczepiać do kanalików nasiennych w celu uzyskania kolonizacji.

Kontrola pacjentów Pacjenci będą poddawani zwykłej obserwacji w klinice onkologicznej do czasu, gdy nie będą już wymagane regularne badania obrazowe, kiedy to zostaną przeniesieni do wspólnej kliniki onkologii/endokrynologii „Late Effects” w RHCYP w Edynburgu. Pacjenci będą poddawani przeglądom co 3 miesiące przez okres dzieciństwa i dojrzewania w celu monitorowania wzrostu i stanu dojrzewania. Kolejne kontrole będą odbywać się co 3 miesiące do roku. Dojrzewanie płciowe będzie oceniane na podstawie badania klinicznego metodą klasyfikacji Tannera, a także pomiaru poziomu gonadotropin, testosteronu i inhibiny B we krwi. Objętość jąder będzie mierzona za pomocą orchidometru Pradera, a co roku wykonywane będzie badanie USG jąder w celu oceny wzrostu jąder i monitorowania ich rozwoju. blizny lub uszkodzenia powstałe w wyniku biopsji. Kluczowym wnioskiem jest częstość występowania niewydolności gonad (dzielonej na spermatogenną i endokrynną) u chłopców, u których wykonano biopsję jąder w porównaniu z chłopcami z podobnymi lub innymi rozpoznaniami, u których nie wykonano biopsji. Zapewni to wykrycie niepożądanych skutków biopsji w mało prawdopodobnym przypadku, a także umożliwi modyfikację kryteriów wyboru biopsji i kriokonserwacji tkanki jądra.