Crioconservazione del tessuto testicolare prepuberale per la preservazione della fertilità nei ragazzi affetti da cancro

Obiettivi

1. Obiettivo primario

   a) Crioconservazione del tessuto testicolare di pazienti pre e peri-puberali sottoposti a terapia potenzialmente sterilizzante per un futuro uso terapeutico per preservare la fertilità.

   io. Sviluppo/perfezionamento dei criteri di inclusione ed esclusione ii. Esplorazione degli atteggiamenti di pazienti e genitori nei confronti di questo approccio alla preservazione della fertilità iii. Sviluppo del gruppo multidisciplinare necessario per fornire questo

2. Obiettivi secondari

   1. Pazienti di follow-up dopo la crioconservazione del tessuto testicolare
   2. Ricerca di laboratorio - sviluppo di cellule germinali testicolari per la preservazione della fertilità i. Sviluppo di metodi di congelamento ottimali per il tessuto testicolare ii. Metodi di coltura in vitro per la maturazione delle cellule germinali iii. Sviluppo di approcci di xenotrapianto per la maturazione delle cellule germinali

Disegno Studio prospettico di coorte di ragazzi pre e peri-puberali

Popolazione in studio Ragazzi in età pre e peri-puberale destinati a sottoporsi a terapia con alto rischio di successiva infertilità

Endpoint principale dello studio Crisoconservazione riuscita a lungo termine del tessuto testicolare per un potenziale uso futuro nella preservazione della fertilità e follow-up dei pazienti per gli effetti della biopsia testicolare sulla successiva funzione endocrina

Definizione di tecniche di laboratorio per lo sviluppo di metodi per supportare la conservazione a lungo termine di tessuti e metodi per la spermatogenesi in vivo/in vitro

Metodi

Reclutamento dei pazienti I pazienti verranno reclutati dal Dipartimento di Oncologia del RHCYP di Edimburgo. La crioconservazione testicolare sarà offerta ai pazienti idonei a condizione che soddisfino i criteri di inclusione. Ai pazienti verranno fornite schede informative adeguate all'età.

Consenso del paziente Il consenso riguarderà la crioconservazione e la conservazione del tessuto testicolare. I pazienti avranno anche la possibilità di consentire l’utilizzo dei tessuti per scopi di ricerca, tuttavia il rifiuto di questo aspetto non impedirà loro di acconsentire alla crioconservazione dei tessuti. A causa della giovane età e dell'immaturità dei pazienti dello studio, il consenso informato scritto per una biopsia testicolare in anestesia generale sarà ottenuto dai genitori/tutore del paziente, a meno che i pazienti non siano considerati in grado di fornire essi stessi un consenso pienamente informato. Verrà richiesto il consenso del paziente a quei ragazzi non considerati competenti a fornire il consenso informato scritto a causa della loro giovane età.

Procedura chirurgica La biopsia testicolare avrà luogo nelle sale operatorie dell'RHCYP prima dell'inizio del trattamento gonadotossico per il cancro. Ciò coinciderà, quando possibile, con una procedura di routine pianificata che richiede l'anestesia generale per evitare la necessità di un'anestesia aggiuntiva, quindi ciò non comporterà un ritardo nell'inizio del trattamento. Verrà prelevato un campione di sangue per lo screening virale che è un requisito per la conservazione dei tessuti. Il campione di sangue verrà conservato per consentire ulteriori test per le malattie infettive come richiesto nel tempo dai Tissue Services e dall'HTA.

Il volume testicolare sarà valutato mediante ispezione visiva e palpazione manuale durante l'intervento chirurgico. La quantità di tessuto rimosso sarà generalmente di circa 0,6-0,8 ml da un testicolo e mai superiore al 50% del volume totale di un singolo testicolo. La procedura comporterà una biopsia testicolare aperta unilaterale attraverso un'incisione scrotale.

Poiché il trattamento con terapia citotossica non sarà iniziato prima della biopsia, il rischio di infezione è minimo. Nei pazienti con tumori solidi è improbabile che il sanguinamento costituisca un grosso problema poiché il numero e la funzione delle piastrine sono generalmente normali in questi pazienti. Nei pazienti affetti da leucemia è probabile che sia presente trombocitopenia al momento della diagnosi, ma in questi pazienti l'emostasi viene solitamente assicurata mediante trasfusione di piastrine per le procedure operatorie.

La biopsia verrà eseguita per la crioconservazione del tessuto testicolare, mentre una parte del campione verrà destinata alla ricerca di laboratorio (se è stato ottenuto il consenso a tale scopo). Nei pazienti in età puberale, il tessuto da crioconservare verrà immediatamente analizzato da un embriologo esperto per la presenza di spermatozoi utilizzando metodi standard. Se sono presenti spermatozoi, una parte del campione verrà utilizzata per l'estrazione e la conservazione dello sperma testicolare (TESE), mentre il tessuto rimanente verrà crioconservato utilizzando i metodi descritti di seguito.

Crioconservazione del tessuto testicolare Il tessuto testicolare verrà conservato secondo i termini di licenza dell'HTA. I campioni vengono raccolti nella soluzione salina bilanciata di Hank sterile (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgio) e trasportati ai Tissue Services per la crioconservazione e la conservazione.

1. Crioconservazione di tessuto testicolare immaturo La crioconservazione di ITT viene eseguita posizionando due pezzi di tessuto in ciascuna criovial contenente DMSO 0,7 M (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgio), con saccarosio 0,1 M (+ S; 10274-5c; VWR, Leuven, Belgio) e 10 mg/ml HSA come precedentemente descritto (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). L'equilibratura viene eseguita a +4°C per 30 minuti. Utilizzando un congelatore programmabile, le fiale vengono raffreddate a 1°C/min mantenendole a 0°C per 5 minuti, seguite da raffreddamento a 0,5°C/min fino a 20°C. A questa temperatura il programma viene sospeso per 10 minuti per consentire la semina manuale. Il programma continua ad una velocità di 0,5°C/min fino a 240°C, mantenuta per 10 minuti, e continua fino a 270°C a 7°C/min, con successiva immersione in azoto liquido.
2. Crioconservazione di tessuto testicolare maturo Ogni biopsia viene tritata accuratamente con due aghi sottili in una capsula Petri con 2 ml di HBSS o fluido tubulare umano, integrato con HSA al 2,5% (adattato da Verheyen, De Croo et al. 1995). Dopo la centrifugazione della sospensione di tessuto/cellula a 500 g per 10 minuti e la rimozione del surnatante, il pellet viene risospeso in 200 µl di HBSS o fluido tubulo umano, addizionato con HSA al 2,5%. SpermFreeze (Vitrolife) (viene aggiunto lentamente in un rapporto di 1:1 (v/v) alla sospensione. Dopo 20 minuti di equilibrazione a 37°C, la sospensione di sperma viene aspirata in una criostraw da 500 µL (IMV, l'Aigle Cedex, Francia). Il raffreddamento e il congelamento vengono effettuati sotto controllo computerizzato utilizzando un programma standard per gli spermatozoi eiaculati (Verheyen, Pletincx et al. 1993). Le paillette vengono posizionate nella camera di un congelatore biologico programmabile e raffreddate secondo il seguente programma: (i) velocità di raffreddamento di -1°C/min dalla temperatura ambiente a 4°C (ii) mantenimento per 1 minuto (iii) congelamento velocità di -5°C/min da 4°C a -80°C (iv) immergere in azoto liquido (-196 °C).

Ricerca di laboratorio Lo scopo principale di questa applicazione è conservare il tessuto testicolare dei pazienti che potrebbe essere utilizzato in futuro per preservare la fertilità, se necessario. Tuttavia, verrà richiesto il consenso anche per l'utilizzo di una porzione extra di tessuto per ricerche di laboratorio. Oltre a ottenere il tessuto come descritto sopra, i ricercatori utilizzeranno anche tessuti ottenuti da una fonte alternativa di tessuto ottenuto da un centro collaboratore (John Radcliffe Hospital, Oxford, Regno Unito). Questa seconda fonte di materiale testicolare umano prepuberale sarà conservata con una licenza HTA (riferimento: 11106) in cui è stato precedentemente ottenuto il consenso per l'uso del tessuto nella ricerca approvata, inclusa la ricerca sugli animali.

Questo tessuto testicolare verrà utilizzato per tre aspetti principali della ricerca di laboratorio

1. Metodi di congelamento ottimali per tessuti e cellule di testicoli pre-puberali

   Le condizioni di congelamento devono essere ottimizzate e migliorate con componenti di grado clinico privi di xeno prima di poter prendere in considerazione l'applicazione clinica. I ricercatori valuteranno l'uso di vari crioprotettori sulla sopravvivenza e sul potenziale di sviluppo delle cellule germinali all'interno della porzione di tessuto pre-puberale prelevata per la ricerca. La vitalità e la funzionalità post-scongelamento saranno valutate mediante immunoistochimica, citometria a flusso e RT-PCR. Per valutare le proprietà funzionali del tessuto dopo il congelamento, il tessuto verrà xenotrapiantato o utilizzato per la coltura in vitro.

2. Coltura in vitro di tessuto testicolare pre-puberale

   La coltura di organi tissutali testicolari utilizzando un sistema di agar morbido ha prodotto una spermatogenesi completa utilizzando testicoli di topo neonatale (Sato, Katagiri et al. 2011). Questo metodo sarà adattato per l'uso con il tessuto testicolare umano pre-puberale studiando gli effetti di diversi terreni di coltura, siero e aggiunta di gonadotropine/altri fattori di crescita per stimolare la differenziazione delle cellule germinali. Ciò sarà valutato mediante analisi istologica ed espressione di marcatori per spermatogoni (ad es. MAGE-A4, Thy-1), spermatociti (ad es. SCP-3, Prohibitin) e spermatidi (ad es. Protamine-2, SP-10) che saranno studiati con diverse metodologie, tra cui qPCR, citometria a flusso ed espressione proteica. Verranno prese in considerazione modifiche delle condizioni di coltura mediante l'aggiunta delle seguenti sostanze: (1) Sostituzione del siero knock-out (KO-SR) in quanto ha indotto la spermatogenesi completa nella coltura di tessuto testicolare di topo neonatale (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) Acido retinoico in quanto ha un ruolo noto nella meiosi e nella differenziazione spermatogenica; (3) Testosterone poiché elevate concentrazioni di testosterone sono essenziali per la spermatogenesi in vivo.

3. Xenotrapianto

Lo xenotrapianto di testicolo rappresenta un sistema modello per studiare i fattori necessari per stabilire la nicchia delle cellule staminali spermatogoniali (SSC) (Mitchell, Saunders et al. 2010). Il tessuto testicolare verrà xenotrapiantato nei topi, ectopicamente (pelle dorsale, scroto, capsula renale) o direttamente nel testicolo per costituire il pool di SSC. I ricercatori esamineranno quali fattori sono responsabili del mantenimento della nicchia SSC utilizzando studi avanzati di co-localizzazione immunoistochimica consolidati. I ricercatori determineranno l'espressione proteica nelle SSC e nella nicchia circostante, comprese le cellule somatiche, la lamina basale e il sistema vascolare. Ciò includerà proteine ​​che hanno dimostrato di essere importanti nell'autorinnovamento/differenziazione delle SSC nei roditori, come c-kit/KITL e GDNF/Gfrα1. Gli innesti verranno mantenuti anche per periodi più lunghi al fine di indagare la successiva differenziazione delle cellule germinali oltre lo stadio spermatogoniale indagando la morfologia e l'espressione di marcatori meiotici come descritto per il lavoro in vitro. Verranno inoltre determinati gli effetti sull'instaurarsi della spermatogenesi mediante esposizione di xenotrapianti a gonadotropine esogene (LH/hCG +/- FSH). Inoltre, l'approccio dello xenotrapianto verrà utilizzato per ottenere SSC che potranno poi essere propagate e/o trapiantate nei tubuli seminiferi per ottenere la colonizzazione.

Follow-up dei pazienti I pazienti verranno seguiti normalmente nella clinica di oncologia fino a quando non saranno più tenuti a sottoporsi a regolare imaging di sorveglianza quando verranno trasferiti alla clinica congiunta di oncologia/endocrinologia "Effetti tardivi" presso il RHCYP di Edimburgo. I pazienti verranno esaminati ogni 3 mesi durante l'infanzia e la pubertà per monitorare la crescita e lo stato puberale. Il follow-up successivo sarà compreso tra 3 mensili e annuali. La pubertà sarà valutata mediante esame clinico utilizzando la stadiazione di Tanner e anche misurando i livelli ematici di gonadotropine, testosterone e inibina B. I volumi testicolari saranno misurati utilizzando un orchidometro Prader e verrà eseguita un'ecografia annuale dei testicoli per valutare la crescita testicolare e monitorarne la presenza. cicatrici o danni a seguito della biopsia. Un risultato chiave è la prevalenza dell'insufficienza gonadica (suddivisa in spermatogenica ed endocrina) nei ragazzi che hanno subito biopsie testicolari rispetto a quelli con diagnosi simili e altre diagnosi che non l'hanno fatta. Ciò garantirà che, nell'improbabile caso in cui si verifichino effetti avversi della biopsia, questi verranno rilevati e consentirà inoltre la modifica dei criteri di selezione per la biopsia e la crioconservazione del tessuto testicolare.