A pubertás előtti hereszövet mélyhűtése a termékenység megőrzése érdekében rákos fiatal fiúkban

Célok

1. Az elsődleges célkítűzés

   a) A termékenység megőrzése érdekében potenciálisan sterilizáló terápián áteső pre- és peripubertás betegek hereszövetének mélyhűtése.

   én. A befogadási és kizárási kritériumok kidolgozása/finomítása ii. A betegek és a szülők hozzáállásának feltárása a termékenység megőrzésének e megközelítéséhez iii. Az ehhez szükséges multidiszciplináris csoport kialakítása

2. Másodlagos célok

   1. A betegek nyomon követése a hereszövet mélyhűtése után
   2. Laboratóriumi kutatás - herecsírasejt-fejlesztés a termékenység megőrzése érdekében i. A hereszövet optimális fagyasztási módszereinek kidolgozása ii. In vitro tenyésztési módszerek a csírasejt érésére iii. Xenografálási megközelítések fejlesztése csírasejtek érésére

Tervezés Prospektív kohorsz vizsgálat pre- és peripubertás fiúkról

Vizsgálati populáció A pre- és peripubertás fiúk, akik terápián estek át, és magas a későbbi meddőség kockázata

A vizsgálat fő végpontja A hereszövet sikeres, hosszú távú fagyasztott tárolása a termékenység megőrzésében való esetleges jövőbeni felhasználás céljából, valamint a betegek nyomon követése a herebiopsziának a későbbi endokrin funkcióra gyakorolt ​​hatásai tekintetében

Laboratóriumi technikák kidolgozása a szövetek hosszú távú tárolását támogató módszerek és in vivo/in vitro spermatogenezis módszereinek kidolgozására

Mód

Betegfelvétel A betegeket az edinburghi RHCYP Onkológiai Osztályáról veszik fel. A herék mélyhűtését felkínálják a jogosult betegeknek, feltéve, hogy megfelelnek a felvételi kritériumoknak. A betegek életkoruknak megfelelő betegtájékoztatót kapnak.

A beteg hozzájárulása A beleegyezés a hereszövet mélyhűtésére és tárolására vonatkozik. A betegeknek lehetőségük lesz arra is, hogy engedélyezzék a szövetek kutatási célú felhasználását, azonban ennek a szempontnak a visszautasítása nem akadályozza meg őket abban, hogy hozzájáruljanak a szövetek mélyhűtéséhez. A vizsgálatban részt vevő betegek fiatal kora és éretlensége miatt az általános érzéstelenítés alatti herebiopsziához írásos beleegyezést kell beszerezni a beteg szüleitől/gondviselőjétől, kivéve, ha a betegek képesek arra, hogy maguk is teljes körű tájékoztatáson alapuló beleegyezést adjanak. A betegek hozzájárulását ki kell kérni azoktól a fiúktól, akik fiatal koruk miatt nem tekinthetők kompetensnek ahhoz, hogy írásos beleegyezést adjanak.

Sebészeti eljárás A herebiopsziára az RHCYP műtőiben kerül sor a rák gonadotoxikus kezelésének megkezdése előtt. Ez lehetőség szerint egybeesik egy tervezett rutin eljárással, amely általános érzéstelenítést igényel, hogy elkerülhető legyen a további érzéstelenítés, így ez nem okoz késedelmet a kezelés megkezdésében. Vérmintát vesznek a vírusszűréshez, ami a szövetek tárolásának feltétele. A vérmintát tárolják, hogy lehetővé tegyék a fertőző betegségek további vizsgálatát, ahogy azt a Tissues Services és a HTA idővel megköveteli.

A here térfogatát szemrevételezéssel és kézi tapintással értékelik a műtét során. Az eltávolított szövet mennyisége általában körülbelül 0,6-0,8 ml egy heréből, és soha nem haladhatja meg egyetlen here teljes térfogatának 50%-át. Az eljárás egyoldalú, nyitott here biopsziát foglal magában, herezacskó bemetszésen keresztül.

Mivel a citotoxikus kezelést nem kezdték meg a biopszia előtt, a fertőzés kockázata minimális. A szolid daganatos betegeknél a vérzés valószínűleg nem jelent komoly problémát, mivel ezeknél a betegeknél a vérlemezkeszám és a funkció általában normális. Leukémiában szenvedő betegeknél valószínűleg thrombocytopenia áll fenn a diagnóziskor, de a hemosztázist rutinszerűen thrombocyta-transzfúzióval biztosítják a műtéti eljárások során.

A biopsziát a hereszövet mélyhűtéséhez veszik, a minta egy részét pedig laboratóriumi kutatásra fordítják (ha erre a célra engedélyt kaptak). Pubertás korú betegeknél a mélyhűtéshez szükséges szövetet egy tapasztalt embriológus standard módszerekkel azonnal megvizsgálja spermium jelenlétére vonatkozóan. Ha spermiumok vannak jelen, a minta egy részét a here spermiumok extrakciójára (TESE) és tárolásra használják fel, míg a fennmaradó szövetet az alábbiakban ismertetett módszerekkel mélyhűtve tárolják.

A hereszövet mélyhűtése A hereszövetet a HTA licencfeltételei szerint tárolják. A mintákat steril Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatba gyűjtik (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgium), és a Tissue Serviceshez szállítják mélyhűtés és tárolás céljából.

1. Éretlen hereszövet mélyhűtése Az ITT mélyhűtését úgy végezzük, hogy minden 0,7 M DMSO-t (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium), 0,1 M szacharózzal (+S; 10274-5c; VWR, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, Leuven, 10274-5c Belgium) és 10 mg/ml HSA a korábban leírtak szerint (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). Az egyensúlyozást +4°C-on 30 percig végezzük. Programozható fagyasztó segítségével az ampullákat 1 °C/perc sebességgel hűtik 0 °C-on tartva 5 percig, majd 0,5 °C/perc sebességgel 20 °C-ra hűtik. Ezen a hőmérsékleten a program 10 percre leáll, hogy lehetővé tegye a kézi vetést. A program 0,5°C/perc sebességgel folytatódik 240°C-ig, 10 percig tartva, majd 270°C-ig 7°C/perc sebességgel, majd folyékony nitrogénbe merüléssel.
2. Érett hereszövet mélyhűtése Minden biopsziát óvatosan két finom tűvel felaprítanak egy Petri-csészében 2 ml HBSS-sel vagy Human Tubule Fluiddal, kiegészítve 2,5% HSA-val (Verheyen, De Croo és munkatársai, 1995). A szövet/sejt szuszpenzió 500 g-vel 10 percig tartó centrifugálása és a felülúszó eltávolítása után a pelletet 2,5% HSA-val kiegészített 200 µl HBSS-ben vagy Human Tubule Fluidban újraszuszpendáljuk. SpermFreeze-t (Vitrolife) (lassan, 1:1 (v/v) arányban adjuk a szuszpenzióhoz. 20 perces, 37 °C-on történő egyensúlyozás után a spermiumszuszpenziót 500 µl-es krioszalmába szívjuk (IMV, l'Aigle Cedex, Franciaország). A hűtést és a fagyasztást számítógépes vezérléssel végezzük, egy szabványos program segítségével, amely az ejakulált spermiumokra vonatkozik (Verheyen, Pletincx et al. 1993). A szívószálakat egy programozható biológiai fagyasztó kamrájába helyezzük, és a következő program szerint hűtjük: (i) -1°C/perc hűtési sebesség szobahőmérsékletről 4°C-ra (ii) 1 percig tart (iii) fagyasztás -5 °C/perc sebesség 4 °C és -80 °C között (iv) folyékony nitrogénbe (-196 °C) meríteni.

Laboratóriumi kutatás Az alkalmazás elsődleges célja a betegek hereszövetének tárolása, amelyet a jövőben szükség esetén termékenység megőrzésére is felhasználhatnak. Mindazonáltal beleegyezést kell kérni egy extra szövetrészlet laboratóriumi kutatáshoz való felhasználásához is. A fent leírt szövetek kinyerése mellett a vizsgálók egy együttműködő központtól (John Radcliffe Hospital, Oxford, Egyesült Királyság) származó alternatív szövetforrásból származó szöveteket is felhasználnak. A humán prepubertáskori hereanyag második forrását egy HTA-engedély (hivatkozási szám: 11106) alapján tárolják, amelyben előzetesen engedélyt kaptak a szövet jóváhagyott kutatásban való felhasználásához, beleértve az állatkísérleteket is.

Ezt a hereszövetet a laboratóriumi kutatás három fő szempontjához fogják használni

1. Optimális fagyasztási módszerek a pubertás előtti hereszövet és -sejtek számára

   A fagyasztási körülményeket optimalizálni és xenomentes klinikai minőségű összetevőkkel kell javítani, mielőtt a klinikai alkalmazást megfontolnák. A kutatók felmérik a különböző krioprotektánsok alkalmazását a csírasejtek túlélésére és fejlődési potenciáljára a pubertás előtti szövet kutatásra vett részében. A felolvasztás utáni életképességet és funkcionalitást immunhisztokémiával, áramlási citometriával és RT-PCR-rel értékeljük. A szövet funkcionális tulajdonságainak fagyasztás utáni értékelése érdekében a szövetet xenografáljuk vagy in vitro tenyésztésre használjuk.

2. A pubertás előtti hereszövet in vitro tenyésztése

   A lágy agarrendszert alkalmazó hereszövet szervtenyészet teljes spermatogenezist eredményezett újszülött egér heréivel (Sato, Katagiri et al. 2011). Ezt a módszert humán prepubertás hereszövettel való használatra adaptálják a különböző táptalajok, szérum, valamint a csírasejt-differenciálódást serkentő gonadotropinok/egyéb növekedési faktorok hozzáadásának vizsgálatával. Ezt szövettani elemzéssel és a spermatogónia markereinek expressziójával értékelik (pl. MAGE-A4, Thy-1), spermatociták (pl. SCP-3, Prohibitin) és spermatidák (pl. Protamin-2, SP-10), amelyeket különböző módszerekkel vizsgálnak, beleértve a qPCR-t, az áramlási citometriát és a fehérje expressziót. Figyelembe kell venni a tenyésztési körülmények módosítását a következő anyagok hozzáadásával: (1) Knock-out Serum Replacement (KO-SR), mivel teljes spermatogenezist indukált újszülött egér hereszövettenyészetben (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) A retinsav, mivel ismert szerepe van a meiózisban és a spermatogén differenciálódásban; (3) A tesztoszteron, mivel a tesztoszteron magas koncentrációja elengedhetetlen az in vivo spermatogenezishez.

3. Xenografálás

A here xenografting modellrendszert képvisel a spermatogoniális őssejt (SSC) rés kialakításához szükséges tényezők vizsgálatára (Mitchell, Saunders et al. 2010). A hereszövetet egerekben ektopikusan (háti bőr, herezacskó, vesekapszula) vagy közvetlenül a herébe helyezik át az SSC pool létrehozása érdekében. A kutatók fejlett immunhisztokémiai ko-lokalizációs vizsgálatok segítségével megvizsgálják, mely tényezők felelősek az SSC-rés fenntartásáért. A kutatók meghatározzák a fehérje expresszióját az SSC-kben és a környező résekben, beleértve a szomatikus sejteket, a bazális laminát és az érrendszert. Ez magában foglalja azokat a fehérjéket, amelyekről kimutatták, hogy fontosak az SSC önmegújulásában/differenciálódásában rágcsálókban, mint például a c-kit/KITL és a GDNF/Gfrα1. A graftokat hosszabb ideig is fenntartják annak érdekében, hogy megvizsgálják a csírasejtek későbbi differenciálódását a spermatogoniális stádiumon túl, a meiotikus markerek morfológiájának és expressziójának vizsgálatával, például az in vitro munkánál leírtak szerint. A xenograftok exogén gonadotropinoknak (LH/hCG +/- FSH) való expozíciójának a spermatogenezis kialakítására gyakorolt ​​hatásait is meghatározzák. Ezenkívül a xenografálási megközelítést SSC-k előállítására fogják használni, amelyeket azután szaporítani és/vagy ondó tubulusokba lehet átültetni a kolonizáció elérése érdekében.

A betegek nyomon követése A betegeket a szokásos módon az Onkológiai Klinikán nyomon követik mindaddig, amíg már nem lesz szükségük rendszeres felügyeleti képalkotásra, amikor is átszállítják őket az edinburghi RHCYP közös Onkológiai/endokrinológiai „Late Effects” klinikájára. A betegeket 3 havonta felülvizsgálják gyermekkoron és pubertáson át, hogy figyelemmel kísérjék a növekedést és a pubertás állapotát. A későbbi nyomon követés 3 havonta és évente történik. A pubertást a Tanner Staging alkalmazásával végzett klinikai vizsgálattal, valamint a gonadotropinok, a tesztoszteron és az inhibin B vérszintjének mérésével értékelik. A heretérfogatot Prader orchidométerrel mérik, és a herék éves ultrahangvizsgálatát végzik el a herék növekedésének felmérésére és a herék monitorozására. hegesedés vagy károsodás a biopszia következtében. A kulcsfontosságú eredmény az ivarmirigy-elégtelenség (spermatogén és endokrin) előfordulása azoknál a fiúknál, akiknél herebiopsziát végeztek, összehasonlítva azokkal, akiknek hasonló vagy más diagnózisuk nem volt. Ez biztosítja, hogy abban a valószínűtlen esetben, ha a biopszia káros hatásai jelentkeznének, ezt kimutatják, és lehetővé teszi a biopszia és a hereszövet mélyhűtésére vonatkozó kiválasztási kritériumok módosítását is.