Kryokonservierung von präpubertärem Hodengewebe zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei krebskranken Jungen

Ziele

1. Hauptziel

   a) Kryokonservierung von Hodengewebe von prä- und peripubertären Patienten, die sich einer potenziell sterilisierenden Therapie unterziehen, für zukünftige therapeutische Zwecke zur Erhaltung der Fruchtbarkeit.

   ich. Entwicklung/Verfeinerung von Einschluss- und Ausschlusskriterien ii. Untersuchung der Einstellungen von Patienten und Eltern zu diesem Ansatz zur Erhaltung der Fruchtbarkeit iii. Aufbau der hierfür erforderlichen multidisziplinären Gruppe

2. Sekundäre Ziele

   1. Follow-up-Patienten nach Kryokonservierung von Hodengewebe
   2. Laborforschung - Entwicklung von Hodenkeimzellen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit i. Entwicklung optimaler Einfriermethoden für Hodengewebe ii. In-vitro-Kulturmethoden zur Keimzellreifung iii. Entwicklung von Xenografting-Ansätzen zur Reifung von Keimzellen

Design Prospektive Kohortenstudie an prä- und peripubertären Jungen

Studienpopulation Jungen vor und in der Pubertät, die sich einer Therapie unterziehen müssen, bei der das Risiko einer späteren Unfruchtbarkeit hoch ist

Hauptendpunkt der Studie Erfolgreiche langfristige Kryolagerung von Hodengewebe für eine mögliche zukünftige Verwendung zur Erhaltung der Fruchtbarkeit und Nachuntersuchung von Patienten hinsichtlich der Auswirkungen einer Hodenbiopsie auf die spätere endokrine Funktion

Etablierung von Labortechniken zur Entwicklung von Methoden zur Unterstützung der Langzeitlagerung von Gewebe und Methoden für die In-vivo-/In-vitro-Spermatogenese

Methoden

Patientenrekrutierung Patienten werden aus der Onkologieabteilung des RHCYP in Edinburgh rekrutiert. Geeigneten Patienten wird eine Hoden-Kryokonservierung angeboten, sofern sie die Einschlusskriterien erfüllen. Den Patienten werden altersgerechte Patienteninformationsblätter zur Verfügung gestellt.

Einwilligung des Patienten: Die Einwilligung gilt für die Kryokonservierung und Lagerung des Hodengewebes. Patienten haben auch die Möglichkeit, die Verwendung von Gewebe für Forschungszwecke zu gestatten. Eine Ablehnung dieses Aspekts hindert sie jedoch nicht daran, der Kryokonservierung von Gewebe zuzustimmen. Aufgrund des jungen Alters und der Unreife der Studienpatienten wird eine schriftliche Einverständniserklärung für eine Hodenbiopsie unter Vollnarkose von den Eltern/Erziehungsberechtigten des Patienten eingeholt, es sei denn, es wird davon ausgegangen, dass die Patienten selbst in der Lage sind, eine vollständige Einverständniserklärung abzugeben. Die Zustimmung des Patienten wird von den Jungen eingeholt, die aufgrund ihres jungen Alters nicht als kompetent gelten, eine schriftliche Einverständniserklärung abzugeben.

Chirurgischer Eingriff Die Hodenbiopsie wird in Operationssälen des RHCYP durchgeführt, bevor mit der gonadotoxischen Krebsbehandlung begonnen wird. Dies wird nach Möglichkeit mit einem geplanten Routineeingriff zusammenfallen, der eine Vollnarkose erfordert, um die Notwendigkeit einer zusätzlichen Anästhesie zu vermeiden, sodass dies nicht zu einer Verzögerung des Behandlungsbeginns führt. Für das Virusscreening wird eine Blutprobe entnommen, die für die Gewebeaufbewahrung erforderlich ist. Die Blutprobe wird aufbewahrt, um im Laufe der Zeit weitere Tests auf Infektionskrankheiten zu ermöglichen, die von Tissues Services und der HTA gefordert werden.

Das Hodenvolumen wird durch visuelle Inspektion und manuelle Palpation bei der Operation beurteilt. Die entnommene Gewebemenge beträgt typischerweise etwa 0,6–0,8 ml von einem Hoden und niemals mehr als 50 % des Gesamtvolumens eines einzelnen Hodens. Der Eingriff umfasst eine einseitige offene Hodenbiopsie durch einen Skrotalschnitt.

Da die Behandlung mit einer zytotoxischen Therapie vor der Biopsie nicht begonnen hat, ist das Infektionsrisiko minimal. Bei Patienten mit soliden Tumoren stellen Blutungen wahrscheinlich kein größeres Problem dar, da die Anzahl und Funktion der Blutplättchen bei diesen Patienten im Allgemeinen normal ist. Bei Patienten mit Leukämie liegt zum Zeitpunkt der Diagnose wahrscheinlich eine Thrombozytopenie vor, bei operativen Eingriffen wird bei diesen Patienten die Blutstillung jedoch routinemäßig durch eine Blutplättchentransfusion sichergestellt.

Die Biopsie wird zur Kryokonservierung des Hodengewebes entnommen, wobei ein Teil der Probe für Laboruntersuchungen verwendet wird (sofern hierfür eine Einwilligung vorliegt). Bei pubertären Patienten wird das zu kryokonservierende Gewebe sofort von einem erfahrenen Embryologen mit Standardmethoden auf das Vorhandensein von Spermien analysiert. Wenn Spermien vorhanden sind, wird ein Teil der Probe für die testikuläre Spermienextraktion (TESE) und Lagerung verwendet, während das restliche Gewebe mit den unten beschriebenen Methoden kryokonserviert wird.

Kryokonservierung von Hodengewebe Die Lagerung von Hodengewebe unterliegt den Lizenzbestimmungen der HTA. Die Proben werden in steriler ausgewogener Hank-Kochsalzlösung (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgien) gesammelt und zur Kryokonservierung und Lagerung zu Tissue Services transportiert.

1. Kryokonservierung von unreifem Hodengewebe Die Kryokonservierung von ITT wird durchgeführt, indem zwei Gewebestücke in jedes Kryogefäß gegeben werden, das 0,7 M DMSO (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgien) mit 0,1 M Saccharose (+S; 10274-5c; VWR, Leuven, Belgien) und 10 mg/ml HSA wie zuvor beschrieben (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). Die Äquilibrierung wird 30 Minuten lang bei +4 °C durchgeführt. Unter Verwendung eines programmierbaren Gefrierschranks werden die Fläschchen mit 1 °C/Minute abgekühlt und 5 Minuten lang bei 0 °C gehalten, gefolgt von einer Abkühlung mit 0,5 °C/Minute auf 20 °C. Bei dieser Temperatur wird das Programm für 10 Minuten angehalten, um eine manuelle Aussaat zu ermöglichen. Das Programm wird mit einer Geschwindigkeit von 0,5 °C/Minute bis 240 °C fortgesetzt, 10 Minuten lang gehalten und dann mit 7 °C/Minute bis 270 °C fortgesetzt, mit anschließendem Eintauchen in flüssigen Stickstoff.
2. Kryokonservierung von reifem Hodengewebe Jede Biopsie wird sorgfältig mit zwei feinen Nadeln in einer Petrischale mit 2 ml HBSS oder menschlicher Tubulusflüssigkeit, ergänzt mit 2,5 % HSA (adaptiert von Verheyen, De Croo et al. 1995), zerkleinert. Nach 10-minütiger Zentrifugation der Gewebe-/Zellsuspension bei 500 g und Entfernung des Überstands wird das Pellet in 200 µL HBSS oder menschlicher Tubulusflüssigkeit, ergänzt mit 2,5 % HSA, resuspendiert. SpermFreeze (Vitrolife) (wird langsam im Verhältnis 1:1 (v/v) zur Suspension gegeben. Nach 20-minütiger Äquilibrierung bei 37 °C wird die Spermiensuspension in einen 500-µL-Kryostroh (IMV, l'Aigle Cedex, Frankreich) abgesaugt. Das Kühlen und Einfrieren erfolgt computergesteuert mit einem Standardprogramm für ejakulierte Spermien (Verheyen, Pletincx et al. 1993). Die Strohhalme werden in die Kammer eines programmierbaren biologischen Gefrierschranks gelegt und gemäß dem folgenden Programm abgekühlt: (i) Abkühlrate von -1 °C/Minute von Raumtemperatur auf 4 °C (ii) 1 Minute lang halten (iii) Einfrieren Geschwindigkeit von -5 °C/min von 4 °C auf -80 °C (iv) Eintauchen in flüssigen Stickstoff (-196 °C).

Laborforschung Das Hauptziel dieser Anwendung ist die Speicherung von Hodengewebe von Patienten, das bei Bedarf in Zukunft zur Erhaltung der Fruchtbarkeit verwendet werden kann. Es wird jedoch auch die Zustimmung zur Verwendung einer zusätzlichen Gewebeportion für Laborforschung eingeholt. Zusätzlich zur Gewinnung von Gewebe wie oben beschrieben werden die Forscher auch Gewebe verwenden, das aus einer alternativen Gewebequelle stammt, die von einem Kooperationszentrum (John Radcliffe Hospital, Oxford, UK) bezogen wurde. Diese zweite Quelle menschlichen präpubertären Hodenmaterials wird unter einer HTA-Lizenz (Referenz: 11106) gespeichert, in der zuvor die Zustimmung zur Verwendung des Gewebes in genehmigten Forschungsarbeiten, einschließlich Tierversuchen, eingeholt wurde.

Dieses Hodengewebe wird für drei Hauptaspekte der Laborforschung verwendet

1. Optimale Einfriermethoden für Hodengewebe und -zellen vor der Pubertät

   Bevor eine klinische Anwendung in Betracht gezogen werden kann, müssen die Gefrierbedingungen mit xenofreien Komponenten in klinischer Qualität optimiert und verbessert werden. Die Forscher werden den Einsatz verschiedener Kryoschutzmittel auf das Überleben und Entwicklungspotenzial von Keimzellen innerhalb des für Forschungszwecke entnommenen Teils des präpubertären Gewebes bewerten. Die Lebensfähigkeit und Funktionalität nach dem Auftauen wird durch Immunhistochemie, Durchflusszytometrie und RT-PCR bewertet. Um die funktionellen Eigenschaften des Gewebes nach dem Einfrieren zu bewerten, wird das Gewebe einer Xenotransplantation unterzogen oder für eine In-vitro-Kultur verwendet.

2. In-vitro-Kultur von präpubertärem Hodengewebe

   Die Kultur von Hodengewebeorganen unter Verwendung eines Weichagarsystems hat zu einer vollständigen Spermatogenese unter Verwendung von Hoden neugeborener Mäuse geführt (Sato, Katagiri et al. 2011). Diese Methode wird für die Verwendung mit menschlichem Hodengewebe vor der Pubertät angepasst, indem die Auswirkungen verschiedener Kulturmedien, Serum und der Zugabe von Gonadotropinen/anderen Wachstumsfaktoren zur Stimulierung der Keimzelldifferenzierung untersucht werden. Dies wird durch histologische Analyse und Expression von Markern für Spermatogonie (z. B. MAGE-A4, Thy-1), Spermatozyten (z.B. SCP-3, Prohibitin) und Spermatiden (z.B. Protamin-2, SP-10), die mit verschiedenen Methoden untersucht werden, darunter qPCR, Durchflusszytometrie und Proteinexpression. Modifikationen der Kulturbedingungen durch Zugabe der folgenden Substanzen werden in Betracht gezogen: (1) Knock-out-Serumersatz (KO-SR), da er eine vollständige Spermatogenese in der Hodengewebekultur von neugeborenen Mäusen induzierte (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) Retinsäure, da sie eine bekannte Rolle bei der Meiose und der Differenzierung der Spermatogenese spielt; (3) Testosteron, da hohe Testosteronkonzentrationen für die Spermatogenese in vivo unerlässlich sind.

3. Xenotransplantation

Die Hoden-Xenotransplantation stellt ein Modellsystem zur Untersuchung der Faktoren dar, die zur Etablierung der Nische der Spermatogonialen Stammzellen (SSC) erforderlich sind (Mitchell, Saunders et al. 2010). Hodengewebe wird bei Mäusen ektopisch (Rückenhaut, Hodensack, Nierenkapsel) oder direkt in den Hoden xenotransplantiert, um den SSC-Pool zu etablieren. Die Forscher werden anhand etablierter fortgeschrittener immunhistochemischer Co-Lokalisierungsstudien untersuchen, welche Faktoren für die Aufrechterhaltung der SSC-Nische verantwortlich sind. Die Forscher werden die Proteinexpression in den SSCs und der umgebenden Nische, einschließlich somatischer Zellen, Basallamina und Gefäßsystem, bestimmen. Dazu gehören Proteine, die nachweislich für die Selbsterneuerung/Differenzierung von SSC bei Nagetieren wichtig sind, wie z. B. c-kit/KITL und GDNF/Gfrα1. Transplantate werden auch über längere Zeiträume aufbewahrt, um die anschließende Differenzierung der Keimzellen über das Spermatogonialstadium hinaus zu untersuchen, indem Morphologie und Expression meiotischer Marker untersucht werden, wie sie für In-vitro-Arbeiten beschrieben wurden. Die Auswirkungen auf die Etablierung der Spermatogenese durch die Exposition von Xenotransplantaten gegenüber exogenen Gonadotropinen (LH/hCG +/- FSH) werden ebenfalls bestimmt. Darüber hinaus wird der Xenografting-Ansatz verwendet, um SSCs zu erhalten, die dann vermehrt und/oder in Samenkanälchen transplantiert werden können, um eine Kolonisierung zu erreichen.

Nachsorge der Patienten Die Patienten werden wie gewohnt in der Onkologieklinik nachuntersucht, bis keine regelmäßige Überwachungsbildgebung mehr erforderlich ist. Anschließend werden sie in die gemeinsame Onkologie-/Endokrinologie-Klinik für „Späteffekte“ am RHCYP in Edinburgh verlegt. Die Patienten werden während der Kindheit und Pubertät alle drei Monate untersucht, um Wachstum und Pubertätsstatus zu überwachen. Die anschließende Nachuntersuchung erfolgt alle drei Monate bis jährlich. Die Pubertät wird durch klinische Untersuchung mittels Tanner Staging und auch durch Messung der Blutspiegel von Gonadotropinen, Testosteron und Inhibin B beurteilt. Das Hodenvolumen wird mit einem Prader-Orchidometer gemessen und eine jährliche Ultraschalluntersuchung der Hoden wird durchgeführt, um das Hodenwachstum zu beurteilen und zu überwachen Narben oder Schäden als Folge der Biopsie. Ein wichtiges Ergebnis ist die Prävalenz von Gonadenversagen (unterteilt in spermatogenes und endokrines Versagen) bei Jungen, bei denen eine Hodenbiopsie durchgeführt wurde, im Vergleich zu denen mit ähnlichen oder anderen Diagnosen, bei denen dies nicht der Fall war. Dadurch wird sichergestellt, dass im unwahrscheinlichen Fall, dass es zu unerwünschten Auswirkungen der Biopsie kommen sollte, diese erkannt werden, und es ermöglicht auch eine Änderung der Auswahlkriterien für die Biopsie und die Kryokonservierung von Hodengewebe.