Criopreservación de tejido testicular prepuberal para preservar la fertilidad en niños pequeños con cáncer

Objetivos

1. Objetivo primario

   a) Criopreservación de tejido testicular de pacientes pre y peripuberales sometidos a terapia potencialmente esterilizante para uso terapéutico futuro para preservar la fertilidad.

   i. Desarrollo/refinamiento de criterios de inclusión y exclusión ii. Exploración de las actitudes de los pacientes y padres ante este enfoque de preservación de la fertilidad iii. Desarrollo del grupo multidisciplinario necesario para proporcionar este

2. Objetivos secundarios

   1. Seguimiento de pacientes después de la criopreservación del tejido testicular.
   2. Investigación de laboratorio: desarrollo de células germinales testiculares para preservar la fertilidad i. Desarrollo de métodos óptimos de congelación de tejido testicular ii. Métodos de cultivo in vitro para la maduración de células germinales iii. Desarrollo de enfoques de xenoinjerto para la maduración de células germinales.

Diseño Estudio de cohorte prospectivo de niños pre y peripuberales.

Población de estudio Niños pre y peripuberales que van a someterse a terapia con alto riesgo de infertilidad posterior

Principal criterio de valoración del estudio Crioalmacenamiento exitoso a largo plazo de tejido testicular para su posible uso futuro en la preservación de la fertilidad y seguimiento de los pacientes para detectar los efectos de la biopsia testicular en la función endocrina posterior.

Establecimiento de técnicas de laboratorio para el desarrollo de métodos que respalden el almacenamiento a largo plazo de tejido y métodos para la espermatogénesis in vivo/in vitro.

Métodos

Reclutamiento de pacientes Los pacientes serán reclutados en el Departamento de Oncología del RHCYP en Edimburgo. Se ofrecerá criopreservación testicular a pacientes elegibles siempre que cumplan con los criterios de inclusión. Se proporcionarán a los pacientes hojas de información para pacientes apropiadas para su edad.

Consentimiento del paciente El consentimiento será para la criopreservación y el almacenamiento del tejido testicular. Los pacientes también tendrán la opción de permitir que el tejido se utilice con fines de investigación; sin embargo, rechazar este aspecto no les impedirá dar su consentimiento para la criopreservación del tejido. Debido a la corta edad y la inmadurez de los pacientes del estudio, se obtendrá el consentimiento informado por escrito de los padres o tutores del paciente para una biopsia testicular bajo anestesia general, a menos que se considere que los pacientes pueden dar su consentimiento plenamente informado por sí mismos. Se buscará el consentimiento del paciente de aquellos niños que no se consideren competentes para proporcionar consentimiento informado por escrito debido a su corta edad.

Procedimiento quirúrgico La biopsia testicular se realizará en los quirófanos del RHCYP antes de que comience el tratamiento gonadotóxico contra el cáncer. Siempre que sea posible, esto coincidirá con un procedimiento de rutina planificado que requiera anestesia general para evitar la necesidad de anestesia adicional, por lo que no provocará un retraso en el inicio del tratamiento. Se tomará una muestra de sangre para la detección viral, que es un requisito para el almacenamiento de tejido. La muestra de sangre se almacenará para permitir pruebas adicionales de enfermedades infecciosas según lo requieran con el tiempo los Servicios de Tejidos y la HTA.

El volumen testicular se evaluará mediante inspección visual y palpación manual en el momento de la cirugía. La cantidad de tejido extirpado normalmente será de aproximadamente 0,6 a 0,8 ml. de un testículo, y nunca más del 50% del volumen total de un solo testículo. El procedimiento implicará una biopsia testicular abierta unilateral a través de una incisión escrotal.

Dado que el tratamiento con terapia citotóxica no habrá comenzado antes de la biopsia, el riesgo de infección es mínimo. En pacientes con tumores sólidos, es poco probable que el sangrado sea un problema importante, ya que el número y la función de las plaquetas son generalmente normales en estos pacientes. En pacientes con leucemia es probable que haya trombocitopenia en el momento del diagnóstico, pero la hemostasia se asegura habitualmente mediante transfusión de plaquetas para los procedimientos quirúrgicos en estos pacientes.

La biopsia se tomará para la criopreservación del tejido testicular y una parte de la muestra se destinará a investigación de laboratorio (si se ha obtenido el consentimiento para ello). En pacientes púberes, un embriólogo experimentado analizará inmediatamente el tejido para criopreservación para detectar la presencia de espermatozoides utilizando métodos estándar. Si hay espermatozoides presentes, una parte de la muestra se utilizará para la extracción y el almacenamiento de espermatozoides testiculares (TESE), mientras que el tejido restante se criopreservará utilizando los métodos que se describen a continuación.

Criopreservación de tejido testicular El tejido testicular se almacenará según los términos de licencia de la HTA. Las muestras se recogen en solución salina equilibrada de Hank estéril (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Bélgica) y se transportan a Tissue Services para su criopreservación y almacenamiento.

1. Criopreservación de tejido testicular inmaduro La criopreservación de ITT se realiza colocando dos trozos de tejido en cada criovial que contiene DMSO 0,7 M (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica), con sacarosa 0,1 M (+S; 10274-5c; VWR, Lovaina, Bélgica) y 10 mg/ml de HSA como se describió anteriormente (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). El equilibrio se realiza a +4°C durante 30 min. Utilizando un congelador programable, los viales se enfrían a 1 °C/min manteniéndolos a 0 °C durante 5 min, seguido de enfriamiento a 0,5 °C/min hasta 20 °C. A esta temperatura, el programa se suspende durante 10 minutos para permitir la siembra manual. El programa continúa a una velocidad de 0,5°C/min hasta 240°C, se mantiene durante 10 min y continúa hasta 270°C a 7°C/min, con posterior inmersión en nitrógeno líquido.
2. Criopreservación de tejido testicular maduro Cada biopsia se tritura cuidadosamente con dos agujas finas en una placa de Petri con 2 ml de HBSS o líquido de túbulos humanos, suplementado con HSA al 2,5 % (adaptado de Verheyen, De Croo et al. 1995). Después de la centrifugación de la suspensión de tejido/célula a 500 g durante 10 minutos y la eliminación del sobrenadante, el sedimento se resuspende en 200 µl de HBSS o líquido de túbulos humanos, suplementado con HSA al 2,5 %. SpermFreeze (Vitrolife) (se agrega lentamente en una proporción de 1:1 (v/v) a la suspensión. Después de 20 minutos de equilibrio a 37°C, la suspensión de esperma se aspira en una criopajilla de 500 µl (IMV, l'Aigle Cedex, Francia). El enfriamiento y la congelación se llevan a cabo bajo control informático utilizando un programa estándar para espermatozoides eyaculados (Verheyen, Pletincx et al. 1993). Las pajitas se colocan en la cámara de un congelador biológico programable y se enfrían de acuerdo con el siguiente programa: (i) velocidad de enfriamiento de -1°C/min desde temperatura ambiente a 4°C (ii) mantener durante 1 min (iii) congelación velocidad de -5 °C/min de 4 °C a -80 °C (iv) sumergir en nitrógeno líquido (-196 °C).

Investigación de laboratorio El objetivo principal de esta aplicación es almacenar tejido testicular de pacientes que pueda usarse en el futuro para preservar la fertilidad si es necesario. Sin embargo, también se solicitará el consentimiento para el uso de una porción adicional de tejido para investigaciones de laboratorio. Además de obtener tejido como se describe anteriormente, los investigadores también utilizarán tejidos obtenidos de una fuente alternativa de tejido obtenido de un centro colaborador (Hospital John Radcliffe, Oxford, Reino Unido). Esta segunda fuente de material de testículo prepuberal humano se almacenará bajo una licencia HTA (referencia: 11106) en la que previamente se ha obtenido el consentimiento para el uso del tejido en investigaciones aprobadas, incluida la investigación con animales.

Este tejido testicular se utilizará para tres aspectos principales de la investigación de laboratorio.

1. Métodos de congelación óptimos para células y tejidos de testículos prepuberales.

   Las condiciones de congelación deben optimizarse y mejorarse con componentes de grado clínico libres de xeno antes de que se pueda considerar la aplicación clínica. Los investigadores evaluarán el uso de varios crioprotectores sobre la supervivencia y el potencial de desarrollo de las células germinales dentro de la porción de tejido prepuberal tomado para la investigación. La viabilidad y funcionalidad posteriores a la descongelación se evaluarán mediante inmunohistoquímica, citometría de flujo y RT-PCR. Para evaluar las propiedades funcionales del tejido después de la congelación, el tejido se xenoinjertará o se utilizará para cultivo in vitro.

2. Cultivo in vitro de tejido testicular prepuberal.

   El cultivo de órganos de tejido testicular utilizando un sistema de agar blando ha dado como resultado una espermatogénesis completa utilizando testículos de ratón neonatal (Sato, Katagiri et al. 2011). Este método se adaptará para su uso con tejido testicular prepuberal humano investigando los efectos de diferentes medios de cultivo, suero y la adición de gonadotropinas/otros factores de crecimiento para estimular la diferenciación de células germinales. Esto se evaluará mediante análisis histológico y expresión de marcadores de espermatogonias (p. ej. MAGE-A4, Thy-1), espermatocitos (p. ej. SCP-3, Prohibitina) y espermátidas (p. ej. Protamina-2, SP-10) que se estudiarán con diferentes metodologías, incluyendo qPCR, citometría de flujo y expresión de proteínas. Se considerarán modificaciones de las condiciones de cultivo mediante la adición de las siguientes sustancias: (1) Reemplazo de suero knock-out (KO-SR), ya que indujo la espermatogénesis completa en cultivo de tejido testicular de ratón neonatal (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) Ácido retinoico, ya que tiene un papel conocido en la meiosis y la diferenciación espermatogénica; (3) La testosterona ya que las altas concentraciones de testosterona son esenciales para la espermatogénesis in vivo.

3. Xenoinjerto

El xenoinjerto de testículo representa un sistema modelo para investigar los factores necesarios para establecer el nicho de células madre espermatogoniales (SSC) (Mitchell, Saunders et al. 2010). El tejido testicular se xenoinjerta en ratones, de forma ectópica (piel dorsal, escrotal, cápsula renal) o directamente en los testículos para establecer el grupo de SSC. Los investigadores examinarán qué factores son responsables del mantenimiento del nicho de contacto piel a piel utilizando estudios de colocalización inmunohistoquímica avanzada establecidos. Los investigadores determinarán la expresión de proteínas en las SSC y el nicho circundante, incluidas las células somáticas, la lámina basal y la vasculatura. Esto incluirá proteínas que han demostrado ser importantes en la autorrenovación/diferenciación del SSC en roedores, como c-kit/KITL y GDNF/Gfrα1. Los injertos también se mantendrán durante períodos más prolongados para investigar la diferenciación posterior de las células germinales más allá de la etapa espermatogonial mediante la investigación de la morfología y la expresión de marcadores meióticos como los descritos para el trabajo in vitro. También se determinarán los efectos sobre el establecimiento de la espermatogénesis por exposición de xenoinjertos a gonadotropinas exógenas (LH/hCG +/- FSH). Además, el enfoque de xenoinjerto se utilizará para obtener SSC que luego se pueden propagar y/o trasplantar a túbulos seminíferos para lograr la colonización.

Seguimiento de los pacientes Los pacientes serán seguidos en la clínica de Oncología como de costumbre hasta que ya no sea necesario tener imágenes de vigilancia periódicas cuando serán transferidos a la clínica conjunta de Oncología y Endocrinología de "Efectos tardíos" en el RHCYP de Edimburgo. Los pacientes serán revisados ​​cada 3 meses durante la infancia y la pubertad para controlar el crecimiento y el estado puberal. El seguimiento posterior será entre 3 mensuales y anuales. La pubertad se evaluará mediante un examen clínico utilizando la estadificación de Tanner y también midiendo los niveles sanguíneos de gonadotropinas, testosterona e inhibina B. Los volúmenes testiculares se medirán utilizando un orquidómetro Prader y se realizará una ecografía anual de los testículos para evaluar el crecimiento testicular y monitorear cicatrices o daños como resultado de la biopsia. Un resultado clave es la prevalencia de insuficiencia gonadal (dividida en espermatogénica y endocrina) en niños a quienes se les han realizado biopsias testiculares en comparación con aquellos con diagnósticos similares y otros que no las han recibido. Esto asegurará que en el improbable caso de que existan efectos adversos de la biopsia estos sean detectados y también permitirá modificar los criterios de selección para la biopsia y la criopreservación del tejido testicular.