Kryokonservering av prepubertalt testikkelvev for bevaring av fruktbarhet hos unge gutter med kreft

Mål

1. Hovedmål

   a) Kryokonservering av testikkelvev fra pre- og peri-pubertale pasienter som gjennomgår potensielt steriliserende terapi for fremtidig terapeutisk bruk for å bevare fertiliteten.

   Jeg. Utvikling/foredling av inkluderings- og eksklusjonskriterier ii. Utforskning av pasienters og foreldres holdninger til denne tilnærmingen til fruktbarhetsbevaring iii. Utvikling av nødvendig tverrfaglig gruppe for å gi dette

2. Sekundære mål

   1. Oppfølgingspasienter etter kryokonservering av testisvev
   2. Laboratorieforskning - utvikling av testikkelkjønnsceller for bevaring av fruktbarhet i. Utvikling av optimale frysemetoder for testikkelvev ii. In vitro-kulturmetoder for kjønnscellemodning iii. Utvikling av xenografting-tilnærminger for modning av kjønnsceller

Design Prospektiv kohortstudie av pre- og peri-pubertale gutter

Studiepopulasjon Pre- og peri-pubertale gutter som skal gjennomgå terapi med høy risiko for påfølgende infertilitet

Hovedstudie endepunkt Vellykket langsiktig kryolagring av testikkelvev for potensiell fremtidig bruk i fertilitetsbevaring, og oppfølging av pasienter for effekter av testikkelbiopsi på påfølgende endokrin funksjon

Etablering av laboratorieteknikker for utvikling av metoder for å støtte langtidslagring av vev og metoder for in vivo/in vitro spermatogenese

Metoder

Pasientrekruttering Pasienter vil bli rekruttert fra onkologisk avdeling ved RHCYP i Edinburgh. Testikkelkryokonservering vil bli tilbudt kvalifiserte pasienter forutsatt at de oppfyller inklusjonskriteriene. Alderstilpassede pasientinformasjonsark vil bli gitt til pasientene.

Pasientsamtykke Samtykke vil være for kryokonservering og lagring av testikkelvev. Pasienter vil også ha muligheten til å tillate bruk av vev til forskningsformål, men å avslå dette aspektet vil ikke hindre dem i å samtykke til kryokonservering av vev. På grunn av studiepasientenes unge alder og umodenhet, vil skriftlig informert samtykke for en testikkelbiopsi under generell anestesi innhentes fra pasientens foreldre/foresatte, med mindre pasientene anses i stand til å gi fullt informert samtykke selv. Pasientsamtykke vil bli innhentet fra de guttene som ikke anses som kompetente til å gi skriftlig informert samtykke på grunn av deres unge alder.

Kirurgisk prosedyre Testikkelbiopsien vil finne sted i operasjonssaler ved RHCYP før kreftgonadotoksisk behandling starter. Dette vil, når det er mulig, falle sammen med en planlagt rutineprosedyre som krever generell anestesi for å unngå behov for ytterligere anestesi, og dette vil derfor ikke føre til forsinkelser i behandlingsstart. Det vil bli tatt blodprøve for virusscreening som er et krav for vevslagring. Blodprøven vil bli lagret for å tillate ytterligere testing for infeksjonssykdommer etter behov over tid av Tissues Services og HTA.

Testikkelvolum vil bli vurdert ved visuell inspeksjon og manuell palpasjon ved operasjon. Mengden vev som fjernes vil typisk være ca. 0,6-0,8 ml fra én testis, og aldri over 50 % av det totale volumet til en enkelt testis. Prosedyren vil involvere en ensidig åpen testikkelbiopsi gjennom et scrotalsnitt.

Siden behandling med cellegift ikke vil ha startet før biopsien, er risikoen for infeksjon minimal. Hos pasienter med solide svulster er det usannsynlig at blødning vil være et stort problem siden antall blodplater og funksjon generelt er normal hos disse pasientene. Hos pasienter med leukemi vil trombocytopeni sannsynligvis være tilstede ved diagnose, men hemostase sikres rutinemessig ved blodplatetransfusjon for operative prosedyrer hos disse pasientene.

Biopsien vil bli tatt for kryokonservering av testikkelvev, med en del av prøven til laboratorieforskning (hvis samtykke er innhentet for dette formålet). Hos pubertetspasienter vil vevet for kryokonservering umiddelbart bli analysert av en erfaren embryolog for tilstedeværelse av sæd ved bruk av standardmetoder. Hvis det er sædceller, vil en del av prøven bli brukt til testikkelspermekstraksjon (TESE) og lagring, mens gjenværende vev vil frysekonserveres ved hjelp av metoder beskrevet nedenfor.

Kryokonservering av testikkelvev Testisvev vil bli lagret under lisensvilkårene i HTA. Prøver samles inn i steril Hanks balanserte saltvannsløsning (HBSS; 14175-129; Life Technologies, Merelbeke, Belgia), og transporteres til Tissue Services for kryokonservering og lagring.

1. Kryokonservering av umodent testikkelvev Kryokonservering av ITT utføres ved å plassere to vevsstykker i hvert kryovial som inneholder 0,7 M DMSO (D2650; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia), med 0,1 M sukrose (+S; 10274-5c; VWR, Leuven, VWR, Leuven, Belgia) og 10 mg/ml HSA som tidligere beskrevet (Keros, Hultenby et al. 2007) (Wyns, Curaba et al. 2007). Ekvilibrering utføres ved +4°C i 30 min. Ved å bruke en programmerbar fryser, avkjøles hetteglassene med 1°C/min. mens de holdes ved 0°C i 5 minutter, etterfulgt av avkjøling ved 0,5°C/min til 20°C. Ved denne temperaturen settes programmet på vent i 10 minutter for å tillate manuell såing. Programmet fortsetter med en hastighet på 0,5°C/min til 240°C, holdt i 10 minutter og fortsatte til 270°C ved 7°C/min, med påfølgende dykking i flytende nitrogen.
2. Kryokonservering av modent testikkelvev Hver biopsi hakkes forsiktig med to fine nåler i en petriskål med 2 mL HBSS eller Human Tubule Fluid, supplert med 2,5 % HSA (tilpasset fra Verheyen, De Croo et al. 1995). Etter sentrifugering av vev/cellesuspensjonen ved 500 g i 10 minutter og fjerning av supernatanten, resuspenderes pelleten i 200 µL HBSS eller Human Tubule Fluid, supplert med 2,5 % HSA. SpermFreeze (Vitrolife) (tilsettes sakte i et forhold på 1:1 (v/v) til suspensjonen. Etter 20 minutter med ekvilibrering ved 37°C, aspireres spermsuspensjonen inn i et 500 µL kryostrå (IMV, l'Aigle Cedex, Frankrike). Avkjøling og frysing utføres under datakontroll ved bruk av et standardprogram for ejakulerte sædceller (Verheyen, Pletincx et al. 1993). Sugerørene plasseres i kammeret til en programmerbar biologisk fryser og avkjøles i henhold til følgende program: (i) kjølehastighet på -1°C/min fra romtemperatur til 4°C (ii) hold i 1 min (iii) frysing hastighet på -5°C/min fra 4°C til -80°C (iv) dykk ned i flytende nitrogen (-196°C).

Laboratorieforskning Hovedmålet med denne applikasjonen er å lagre testikkelvev fra pasienter som kan bli brukt i fremtiden for bevaring av fruktbarhet om nødvendig. Det vil imidlertid også søkes om samtykke for bruk av en ekstra porsjon vev til laboratorieforskning. I tillegg til å skaffe vev som beskrevet ovenfor, vil etterforskerne også bruke vev hentet fra en alternativ vevskilde hentet fra et samarbeidende senter (John Radcliffe Hospital, Oxford, Storbritannia). Denne andre kilden til humant prepubertet testismateriale vil bli lagret under en HTA-lisens (referanse: 11106) der det tidligere er innhentet samtykke for bruk av vevet i godkjent forskning, inkludert dyreforskning.

Dette testisvevet vil bli brukt til tre hovedaspekter av laboratorieforskning

1. Optimale frysemetoder for pre-pubertet testisvev og celler

   Fryseforhold må optimaliseres og forbedres med xeno-frie komponenter av klinisk kvalitet før klinisk bruk kan vurderes. Etterforskerne vil vurdere bruken av ulike kryobeskyttende midler på overlevelse og utviklingspotensial for kjønnsceller innenfor den delen av pre-pubertet vev tatt for forskning. Levedyktighet og funksjonalitet etter tining vil bli vurdert ved immunhistokjemi, flowcytometri og RT-PCR. For å evaluere vevets funksjonelle egenskaper etter frysing, vil vevet xenograferes eller brukes til in vitro-kultur.

2. In vitro kultur av pre-pubertalt testikkelvev

   Testisvevsorgankultur ved bruk av et mykt agarsystem har resultert i full spermatogenese ved bruk av neonatale musetestis (Sato, Katagiri et al. 2011). Denne metoden vil bli tilpasset bruk med humant pre-pubertalt testikkelvev ved å undersøke effekten av ulike kulturmedier, serum og tilsetning av gonadotropiner/andre vekstfaktorer for å stimulere kjønnscelledifferensiering. Dette vil bli evaluert ved histologisk analyse og ekspresjon av markører for spermatogoni (f. MAGE-A4, Thy-1), spermatocytter (f.eks. SCP-3, Prohibitin) og spermatider (f.eks. Protamin-2, SP-10) som vil bli studert med ulike metoder, inkludert qPCR, flowcytometri og proteinekspresjon. Modifikasjoner av kulturbetingelsene ved å tilsette følgende stoffer vil bli vurdert: (1) Knock-out serumerstatning (KO-SR) ettersom det induserte fullstendig spermatogenese i testikkelvevskultur fra neonatal mus (Sato, Katagiri et al. 2011); (2) retinsyre som den har en kjent rolle i meiose og spermatogen differensiering; (3) Testosteron da høye konsentrasjoner av testosteron er avgjørende for spermatogenese in vivo.

3. Xenografting

Testis xenografting representerer et modellsystem for å undersøke faktorene som kreves for å etablere spermatogonial stamcelle (SSC) nisje (Mitchell, Saunders et al. 2010). Testisvev vil bli xenografert i mus, ektopisk (dorsal hud, scrotal, nyrekapsel) eller direkte inn i testis for å etablere SSC-poolen. Etterforskerne vil undersøke hvilke faktorer som er ansvarlige for vedlikeholdet av SSC-nisjen ved hjelp av etablerte avanserte immunhistokjemiske samlokaliseringsstudier. Etterforskerne vil bestemme proteinuttrykk i SSC-ene og den omkringliggende nisjen, inkludert somatiske celler, basal lamina og vaskulatur. Dette vil inkludere proteiner som har vist seg å være viktige i SSC-selvfornyelse/-differensiering hos gnagere, slik som c-kit/KITL og GDNF/Gfrα1. Grafts vil også opprettholdes i lengre perioder for å undersøke påfølgende differensiering av kjønnscellene utover spermatogonialstadiet ved å undersøke morfologi og ekspresjon av meiotiske markører som beskrevet for in vitro arbeid. Effektene på etablering av spermatogenese ved eksponering av xenografter for eksogene gonadotropiner (LH/hCG +/- FSH) vil også bli bestemt. Dessuten vil xenografting-tilnærmingen bli brukt for å oppnå SSC-er som deretter kan formeres og/eller transplanteres inn i sædrør for å oppnå kolonisering.

Oppfølging av pasienter Pasienter vil bli fulgt opp i onkologisk klinikk som normalt inntil de ikke lenger er pålagt å ha regelmessig overvåkingsbildebehandling når de vil bli overført til den felles onkologiske/endokrinologiske 'Senvirkningsklinikken' ved RHCYP i Edinburgh. Pasienter vil bli vurdert hver 3. måned gjennom barndommen og puberteten for å overvåke vekst og pubertetsstatus. Påfølgende oppfølging vil være mellom 3 månedlig og årlig. Puberteten vil bli vurdert ved klinisk undersøkelse ved bruk av Tanner Staging og også ved måling av blodnivåer av gonadotropiner, testosteron og Inhibin B. Testikkelvolumer vil bli målt ved hjelp av et Prader-orkidometer og en årlig ultralyd av testiklene vil bli utført for å vurdere testikkelvekst og overvåke for arrdannelse eller skade som følge av biopsien. Et sentralt resultat er forekomsten av gonadalsvikt (delt i spermatogen og endokrin) hos gutter som har tatt testikkelbiopsier sammenlignet med de med lignende og andre diagnoser som ikke har gjort det. Dette vil sikre at i det usannsynlige tilfellet at det er uønskede effekter av biopsien, vil dette bli oppdaget, og det vil også tillate modifisering av seleksjonskriteriene for biopsi og testikkelvevskryokonservering.