Pre-implantatie genetische screening bij vrouwen jonger dan 36 jaar met enkele embryotransfer

Onderzoeksopzet Tussen oktober 2004 en december 2006 werden ovulatoire vrouwen die een onvruchtbaarheidsbehandeling ondergingen, gevraagd deel te nemen aan deze RCT met inachtneming van de volgende inclusiecriteria: leeftijd van de moeder jonger dan 36 jaar, behoefte aan ICSI en beweeglijk sperma (spermaparameters: meer dan 1 x 106 zaadcellen/ml) en beide partners hebben een normaal karyotype. Na schriftelijke geïnformeerde toestemming werden in aanmerking komende paren willekeurig toegewezen aan ICSI, gevolgd door blastocystoverdracht met of zonder PGS op het achtcellige embryo. Randomisatie vond plaats op de polikliniek en elke patiënt kon slechts één keer worden geïncludeerd. Op het toestemmingsformulier stond dat patiënten die aan de PGS-groep waren toegewezen, zouden instemmen met het doneren van embryo's voor onderzoek als deze chromosomaal abnormaal waren of niet geschikt voor terugplaatsing of cryopreservatie. De studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Universitair Ziekenhuis. De patiënten waren op de hoogte van de behandelingstoewijzing en werden op het moment van de transfer geïnformeerd over de waargenomen chromosomale afwijkingen en over de morfologische kwaliteit van de embryo's.

Ovariële stimulatie, eicelpunctie en embryokweek Gecontroleerde ovariële hyperstimulatie werd uitgevoerd in een antagonistprotocol met behulp van recombinant FSH gecombineerd met een GnRH-antagonist (ganirelix, Orgalutran, NV Organon) (Kolibianakis et al., 2004) of een agonistprotocol, met behulp van GnRH-analogen voor hypofyse-desensibilisatie (buserilin, Suprefact; Hoechst, Frankfurt, Duitsland), gecombineerd met menselijke menopauzale gonadotrofines (hMG) (Menopur, Ferring Pharmaceuticals A/S, Kopenhagen, Denemarken) of recombinant FSH (Puregon, NV Organon, Oss, Nederland) (Van de Velde et al., 1998). De uiteindelijke eicelrijping werd geïnduceerd door de toediening van 10.000 IE HCG. Transvaginale echogeleide eicelpunctie was gepland 36 uur na HCG-toediening. ICSI werd gebruikt om de eicellen te bevruchten. Spermabereiding, in-vitrofertilisatie, intracytoplasmatische sperma-injectieprocedures en embryokweek werden uitgevoerd zoals beschreven door Van Landuyt et al. (2005).

Beoordeling van bevruchting en embryo-evaluatie Bevruchting werd beoordeeld als het aantal 2PN zygoten per verkregen COC. Embryo-evaluatie werd uitgevoerd op dag 2 en 3 door het aantal blastomeren en het percentage fragmentatie te registreren. Graad A-embryo's werden gedefinieerd als embryo's zonder kernfragmenten. Graad B-embryo's hadden blastomeren van gelijke of ongelijke grootte, met een maximum van 20% van het volume van het embryo gevuld met anucleaire fragmenten. In embryo's van graad C waren anucleaire fragmenten aanwezig in 20-50% van het volume van het embryo. Graad D-embryo's hadden meer dan 50% van het volume van het embryo gevuld met anucleaire fragmenten. De embryo's werden dagelijks geëvalueerd tot dag 5. Op dag 5 werden de embryo's ingedeeld in gestopte embryo's die geen tekenen van verdichting vertoonden op dag 5, verdichtende embryo's (C1-C2), vroege blastocysten (Bl1-Bl2) en expanderende blastocysten (Bl3-Bl2). Bl7) volgens de classificatie voorgesteld door Gardner en Schoolcraft (1999). Embryo's kwamen pas op dag 5 in aanmerking voor overdracht vanaf het verdichtingsstadium. In beide groepen werden op dag 5 of 6 overtollige embryo's ingevroren.

Embryobiopsie Bij embryo's van graad A, B of C met minimaal vijf blastomeren werd in de ochtend van dag 3 na ICSI een biopsie uitgevoerd (Joris et al., 2003). Deze selectiecriteria om te bepalen of een embryo geschikt was voor biopsie waren dezelfde als die om te bepalen of een embryo op dag 3 in het reguliere ICSI-programma zonder PGD overdraagbaar was. Voorafgaand aan de biopsie van één blastomeer werden de blastomeren gecontroleerd op de aanwezigheid van kernen. Indien bij de fixatie bijgevolg geen nucleair materiaal werd gevonden, werd een tweede blastomeer verwijderd. Embryobiopsie werd uitgevoerd in HEPES-gebufferd medium onder olie met behulp van lasertechnologie (Fertilase) zoals eerder in detail beschreven (Staessen et al., 2004).

Verspreiding van de interfase-kernen en FISH-procedure Met behulp van een mondpipet werden de individuele blastomeren eerst gespoeld in medium en vervolgens overgebracht naar een druppel van 1 µl van 0,01 N HCl/0,1% Tween 20-oplossing (Coonen et al., 1994) op een Superfrost Plus glasplaatje (Kindler GmbH, Freiburg, Duitsland). Een FISH-procedure met twee ronden werd uitgevoerd waardoor we de chromosomen X, Y, 13, 18, 21 (ronde 1) en 16, 22 (ronde 2) konden detecteren, zoals eerder in detail beschreven (Staessen et al., 2004).

FISH-scorecriteria De specifieke FISH-signalen die in een bepaalde blastomeer werden gedetecteerd, werden als volgt geïnterpreteerd: (i) een blastomeer werd als diploïde beschouwd wanneer de twee gonosomen en twee chromosoom 13-, 16-, 18-, 21- en 22-specifieke signalen werden Cadeau; (ii) een blastomeer werd als haploïde, triploïde of tetraploïde beschouwd wanneer respectievelijk één, drie of vier signalen voor de onderzochte chromosomen aanwezig waren; (iii) een blastomeer werd als aneuploïde beschouwd wanneer een extra (trisomisch) of ontbrekend (monosomisch) signaal voor één chromosoom werd waargenomen, in aanwezigheid van twee signalen voor de overige geanalyseerde chromosomen; (iv) een blastomeer werd als gecombineerd abnormaal beschouwd wanneer het noch diploïde, noch haploïde, triploïde, tetraploïde of aneuploïde was. Na FISH-analyse werden op dag 5 alleen embryo's die chromosomaal normaal bleken te zijn in de overeenkomstige gebiopteerde blastomeer teruggeplaatst. FISH-analyse werd uitgevoerd door ervaren cytogenetici die waren opgeleid in cytogenetica en FISH-analyse. De resultaten van de eerste en tweede ronde werden geanalyseerd door twee waarnemers met behulp van een Zeiss Axioplan 2 fluorescentiemicroscoop.

Embryotransfer In de PGS-groep vond de transfer plaats op dag 5 als uit de genetisch normaal bevonden embryo's ten minste één compacterend embryo of vroege blastocyst werd verkregen. In de controlegroep werd de terugplaatsing ook uitgevoerd als op dag 5 minstens één verdichtend embryo of vroege blastocyst werd verkregen; Op dag 3 werden 4 embryotransfers uitgevoerd.

Zwangerschap Een biochemische zwangerschap werd gedefinieerd als twee opeenvolgende positieve stijgende (> 15 IE/ml) serum hCG-spiegels. Een preklinische miskraam werd gedefinieerd als twee opeenvolgende positieve stijgende (> 15 IE/ml) serum-hCG-spiegels, maar geen FHB ten minste 6 weken na de embryotransfer. Een klinische zwangerschap werd gedefinieerd als een intra-uteriene zwangerschapszak met positieve foetale hartactiviteit waargenomen bij echografie uitgevoerd ten minste 6 weken na de embryotransfer. Een miskraam werd gedefinieerd als een zwangerschapsverlies vóór 20 weken zwangerschap. Het geboortecijfer werd gedefinieerd als het aantal levendgeboren bevallingen uitgedrukt per 100 geïnitieerde cycli, aspiratiecycli of embryotransfercycli (Zeghers-Hochschild et al., 2006).

Eindpunt De primaire uitkomstmaat was het aantal levendgeborenen. Statistische analyse Analyse werd uitgevoerd volgens de intentie om te behandelen. Voor beschrijvende statistiek gebruikten we gemiddelden ± SD. Continue variabelen werden geanalyseerd door de t-test voor onafhankelijke steekproeven. Categorische variabelen werden geanalyseerd door chi-kwadraattoets. Alle tests waren tweezijdig en een P-waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistische significantie. Met behulp van groepssequentiële methoden berekenden we dat de inschrijving van 447 patiënten in elke groep de studie een statistisch vermogen van 80% zou geven om een ​​absoluut verschil van 10% in het aantal bevallingen tussen de groepen te detecteren op een alfaniveau van 0,05 met het gebruik van een tweezijdige z-toets.