APAP levertoksisitet etter terapeutiske doser

Paracetamol (acetaminophen, APAP) er et allestedsnærværende smertestillende og febernedsettende middel tilgjengelig over hele verden i en rekke reseptfrie og reseptbelagte medisiner. Ved supraterapeutiske doser er APAP et godt beskrevet hepatotoksisk middel og et betydelig folkehelseproblem siden 30 000 sykehusinnleggelser anslås å være relatert til APAP medikamentindusert leverskade (DILI) hvert år i USA. APAP er faktisk den vanligste årsaken til akutt leversvikt (ALF) i USA og Europa med en estimert total dødelighet på 28 %. Halve APAP-overdoser er utilsiktet, og pasientens dårlige evne til å identifisere produkter med APAP er dokumentert. På sykehus har 1 % av alle legemiddelresepter inneholdt en overdosert APAP-resept som fremhever behovet for økt bevissthet om utilsiktet APAP-overdose.

Ved anbefalt terapeutisk dose på 4g/d anses APAP vanligvis som trygt. Det er imidlertid påvist assosiasjoner mellom terapeutisk dosering av APAP og økninger i alaninaminotransferase (ALT). Faktisk opplevde opptil 1/3 friske frivillige behandlet med terapeutiske doser av APAP 3x ALT-økning (opptil 14x) etter 3 dagers behandling i opptil 11 dager. Disse resultatene ble bekreftet hos pasienter som ikke drikker. Den multinasjonale SALT-studien rapporterte 81 tilfeller av ALF (49 i Frankrike) som førte til transplantasjon etter ikke-overdose APAP-eksponering i en 3-års oppfølging og ikke-overdose APAP var assosiert med en 2 ganger høyere rate av ALF enn NSAIDs. I USA ble 17 % av APAP-indusert ALF over en 41-måneders periode rapportert med en APAP-dose lavere enn 4 g/dag.

Underernæring som risikofaktor Noen forfattere har antydet at terapeutiske doser av APAP kan være hepatotoksiske i nærvær av underernæring og lav kroppsvekt, samt kronisk alkoholforbruk og legemidler som induserer cytokrom P450 (CYP). Ettersom glutation (GSH) syntetiseres fra 3 aminosyrer (aa) (Cys, Glu og Gly), kan protein- eller aa-mangel resultere i GSH-mangel. Hos rotter var faste assosiert med økt APAP levertoksisitet som en konsekvens av hepatisk GSH-reduksjon, og en 16 timers fasteperiode var tilstrekkelig til å tømme GSH-lagrene. GSH-nivåer har vist seg å være redusert hos anorektiske kvinnelige pasienter sammenlignet med kontroller, og en positiv korrelasjon mellom GSH-nivåer og BMI ble observert. En liten retrospektiv studie (n=10) viste at alvorlig levertoksisitet etter moderat APAP-dose (4 til 10 g/dag) i 80 % av tilfellene ble innledet av underernæring. Flere kasusrapporter om alvorlig levertoksisitet (noen dødelig) etter terapeutiske APAP-doser hos underernærte voksne er publisert. I den pediatriske populasjonen ble ALF-tilfeller rapportert etter terapeutiske APAP-doser etter virusinfeksjon og lav ernæringsstatus. Imidlertid har ingen godt utført studie hatt som mål å prospektivt vurdere virkningen av underernæring på toksisiteten til terapeutiske doser av APAP.

FDA-eksperter påpekte at APAP brukes ofte hos kakeksipasienter. Kakeksi er et komplekst syndrom preget av flere homeostatiske forstyrrelser, inkludert progressivt ufrivillig vekttap, ledsaget av sløsing, tidlig metthet, svakhet og anoreksi. Et bredt spekter av klinisk sykdom er assosiert med kakeksi. Forekomsten av underernæring har blitt observert hos 20-29 % av sykehuspasienter i Europa, og 33 % på kirurgiske avdelinger. Pickering et al. demonstrerte at APAP-metabolismen skifter mot de toksiske oksidative banene etter større aortakirurgi, noe som tyder på at disse pasientene kan være spesielt utsatt. Data om legemiddelforbruk indikerer også at APAP-bruken er høy i postoperative innstillinger. British National Formulary har anbefalt en maksimal dose på 60mg/kg IV APAP for bruk hos voksne med vekt under 50kg og 3g/dag IV ved kronisk underernæring eller dehydrering. Overraskende nok er ingen slik anbefaling tilgjengelig for oral APAP og som vanligvis foreskrives uavhengig av ernæringsstatus. Det er sannsynlig at tilfeller av leverskade sekundært til normal anbefalt dose er underrepresentert da dosen ikke oppleves som overdreven og ikke beskrevet som sådan i internasjonale retningslinjer for smertebehandling. Tatt i betraktning den utbredte bruken av APAP og prevalensen av underernæring i operasjonsavdelinger, er det av avgjørende klinisk betydning å avklare om underernæring disponerer for APAP-indusert levertoksisitet ved anbefalt dosering på 4g/dag.

Biomarkør for APAP levertoksisitet:

APAP metaboliseres ved glukuronidering (55 %) og sulfatisering (40 %). Metabolittene til APAP skilles ut av leveren av multilegemiddelresistensassosierte proteiner (36-38). APAP oksideres (5 %) av cytokromene P450 (CYP) 2E1, 3A og 1A2 til det svært reaktive N-acetyl-p-benzo-kinonet (NAPQI), elektrofil og cytotoksisk metabolitt, ansvarlig for APAP levertoksisitet.

Ved terapeutisk dose blir APAP vanligvis raskt avgiftet ved konjugering med GSH, fjernet fra leveren og utskilt i urin. Slattery et al. har vist at GSH-depletering begynner i området 0,5-3g APAP. Etter overdreven APAP-inntak blir både sulfonerings- og glukuronideringsveier mettet til fordel for oksidasjonsveien. Dette resulterer i dannelsen av store mengder NAPQI og lever-GSH-utarming. NAPQI binder seg kovalent til makromolekyler, reagerer med svovelgrupper i leverproteiner, og er ansvarlig for den histopatologiske hepatiske sentrilobulære nekrosen med periportal sparing. N-acetylcystein (NAC) er et rensemiddel for NAPQI. Innen 24 timer etter et enkelt akutt inntak, brukes APAP-plasmakonsentrasjoner til å forutsi sannsynligheten for levertoksisitet og behovet for NAC-motgift. Normogrammet er imidlertid ikke relevant for pasienter som kommer senere enn 24 timer etter inntak eller etter kronisk inntak. Å utvikle og validere en tidlig og lett tilgjengelig markør for hepatotoksisitet vil spesielt være nyttig i høyere risiko og skjøre populasjoner for å forbedre diagnose og håndtering av APAP-indusert levertoksisitet. Faktisk har ukjente tilfeller av APAP levertoksisitet en dårlig prognose, da administrering av motgift ikke vil bli satt i gang eller forsinket. APAP binder seg kovalent til protein som et resultat av en reaksjon mellom NAPQI og cysteinrester for å produsere APAP-CYS proteinaddukter. I APAP-relatert ALF ble toppkonsentrasjoner av APAP-CYS-addukter vist å korrelere med toppkonsentrasjoner av aminotransferase og detektert opptil 12 dager etter inntak. Hos 157 ungdommer og barn med APAP-overdose korrelerte peak APAP-CYS-addukter med peak levertransaminaser, tid til behandling med NAC og risikobestemmelse ved bruk av normogrammet. Det er også vist at APAP-CYS-konsentrasjoner varierte i henhold til eksponeringsgraden og APAP-CYS er spesifikk for APAP-eksponeringer. Imidlertid ble ingen direkte påvisning av APAP-CYS på full-lengde proteiner eller lange polypeptider utført. Deteksjon ble utført etter fordøyelse med en ikke-spesifikk endopeptidase. Dermed er den eksakte adduktposisjonen og identiteten til modifiserte proteiner ukjent.

Binding av kjemiske stoffer på hemoglobin og plasmaalbumin er et velkjent fenomen og de fleste kjemikalier som virker via reaktive metabolitter danner slike addukter. Hemoglobin- og albuminaddukter er lett tilgjengelige fra en blodprøve og har en veldefinert levetid på grunn av fravær av reparasjon. Nylig ble direkte proteinanalyseprotokoller basert på LC-MS/MS-analyse av intakte globinkjeder eller peptider beskrevet for analyse av hemoglobin- og albuminaddukter. Den kliniske nytten av APAP-CYS modifisert albumin og hemoglobin som biomarkører for APAP levertoksisitet vil bli evaluert og sammenlignet med serumnivået av transaminaser, APAP, APAP-CYS og metabolitter.

Mikrovesikler (MV) har gradvis dukket opp som potensielle fruktbare biomarkørholdere. MV-er er sirkulerende vesikler frigjort fra nesten alle celletyper, og er sammensatt av et stort utvalg av biomolekyler som messenger-RNA, mikro-RNA, proteiner og lipider. Interessant nok er sammensetningen deres relatert til deres opprinnelige celle, vev eller organ, og påvirkes av stimulering og mikromiljøendringer av donorcellen. Dette gir dem "signaturer" av en fysiologisk tilstand. MV-er frigjøres raskt i blodet etter en stimuli eller en tilstandsendring og er dermed potensielle tidlige indikatorer på en fysiologisk tilstand, som inneholder verdifull informasjon for overvåking av patologier. Spesifikke molekyler som frigjøres direkte i blodet via MV fra hepatocytter, kan inneholde interessante biomarkørkandidater for å forbedre pasientbehandlingen etter APAP-forgiftning. Kvantitative proteomikkstrategier vil bli brukt for å isolere nye proteinbiomarkører for APAP-indusert levertoksisitet fra MV-er. Alternativt har sirkulerende mikro-RNA vist seg å være kraftige potensielle biomarkører for en rekke sykdommer, inkludert levertoksisitet etter APAP-overdoser. Mikro-RNA er små ~22 nt lange ikke-kodende regulatoriske molekyler som påvirker ekspresjonsnivåene til hundrevis av gener som er stabile i sirkulerende væsker. I tilfeller av APAP-overdoser har flere studier vist at den plasmatiske konsentrasjonen av den leverspesifikke miR122 korrelerer og til og med går litt foran økningen i blodnivåer av de klassiske hepatotoksisitetsmarkørene. Transkriptomisk screening fra plasma og MV vil bli brukt til å identifisere potensielle nye miRNA-kandidater for APAP-indusert levertoksisitet.

Påvisning av nye biomarkører kan være en kjedelig prosess som kan forenkles ved å bruke ekstreme prøver som filtre for å identifisere de mest relevante kandidatene enten på protein- eller nukleinsyrenivå. I forbindelse med denne studien vil ekstreme prøver bli gitt av 6 pasienter som ankommer sykehus etter inntak av en APAP-overdose.

Genetisk markør for følsomhet Genpolymorfismer i legemiddelmetaboliserende enzymer (DME) og transportører involvert i farmakokinetikken til APAP kan brukes som biomarkører for følsomhet for APAP levertoksisitet. Hovedveiene for eliminering av APAP er fase II DME UDP-glukuronosyltransferaser (UGT) og sulfotransferaser (SULT). Tre UGT-isoformer ser ut til å være involvert i APAP-glukuronokonjugering og opptil 15x variasjon i APAP-glukuronokonjugering er påvist. UGT1A1*28 og *6 er assosiert med redusert enzymatisk aktivitet og økt irinotekan toksisitet. Hos dyr hadde UGT-mangelfulle Gunn-rotter en økt følsomhet for APAP sammenlignet med kontroller. Gilbert syndrom er en arvelig hyperbilirubinemi på grunn av UGT1A1*28 som fører til 40 % reduksjon av enzymatisk aktivitet, redusert APAP-glukuronidering og økt aktiv metabolittproduksjon. Sulfatisering av APAP katalyseres hos mennesker av SULT-isoformer som kan ha opptil 50 ganger forskjell i aktivitet. Imidlertid er virkningen av SULT-polymorfismer på APAP-toksisitet ukjent. Bioaktivering av APAP til NAPQI formidles av CYP-familien med CYP2E1 og 2D6 som fremstår som de mest relevante isoformene. Begge er svært polymorfe og kan gjennomgå genduplisering. Cyp2e1knockout-mus er mindre følsomme for APAP hepatotoksiske effekter enn villtype dyr. . Hos mennesker er virkningen av CYP2D6- og 2E1-polymorfismer på APAP-toksisitet ukjent. NAPQI avgiftes av GSTP1 i leveren som to vanlige enkeltnukleotidpolymorfismer (SNPs) er beskrevet for, en av dem reduserer enzymatisk aktivitet. Til slutt er oppregulering av efflukstransportører beskrevet etter giftig APAP-inntak. Dette prosjektet vil ta sikte på å karakterisere in vitro de metabolske veiene involvert i APAP-metabolisme og reaktiv metabolittdannelse, samt deres innvirkning på metabolittproduksjonen.