Wpływ operacji zmniejszenia żołądka na parametry amoksycyliny

Badana populacja

Ośmiu otyłych ochotników obojga płci, w wieku od 18 do 60 lat, zostało wybranych z programu otyłości Generalnego Szpitala Dr. z wykorzystaniem techniki operacyjnej RYGB.

Wszyscy badani podpisali formularz świadomej zgody. Badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) Federalnego Uniwersytetu Ceará, akredytowaną przez Krajową Komisję ds. Etyki Badań – Narodową Radę Zdrowia, Ministerstwo Zdrowia i Komitet Naukowy Szpitala Ogólnego Dr. Césara Calsa. Badanie przeprowadzono zgodnie z zasadami etycznymi Deklaracji Helsińskiej zrewidowanej w 2013 roku oraz Wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej.

Projekt badania i pobieranie próbek farmakokinetycznych

Badanie to przeprowadzono jako monocentryczne, otwarte, randomizowane badanie z pojedynczą dawką z dwoma okresami leczenia – przed operacją (Czas 0 – T0) i 2 miesiące po operacji bariatrycznej (Czas 2 – T2). W każdym okresie otyli ochotnicy otrzymywali pojedynczą doustną dawkę kapsułki 500 mg amoksycyliny (Amoxil®, GlaxoSmithKline Brazil Ltda.) z 200 ml wody po całonocnym poście (około 8 godzin). Badani pozostawali na czczo do 3 godzin po zażyciu leku. Ograniczenie wody i pokarmu utrzymywano do 3 godzin po przyjęciu preparatu. Wszystkim badanym oferowano standardowe posiłki. Ochotników, którzy musieli przyjąć jakiekolwiek leki (hipotensyjne, przeciwcukrzycowe i inne), poinstruowano, aby stosowali je 3 godziny po przyjęciu amoksycyliny. Próbki krwi (6 ml) do oznaczenia stężenia amoksycyliny w osoczu pobrano przez cewnik żylny do heparynizowanych probówek przed podaniem dawki (0 h), 0,33, 0,66, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 6 i 8 h po podaniu. Próbki osocza do analizy chromatograficznej uzyskano przez odwirowanie (2000 g x 12 min w 4°C) próbek krwi. Próbki osocza przechowywano w temperaturze -20°C do czasu analizy.

Parametry antropometryczne przed i po operacji

Podczas każdej wizyty (T0 i T2) mierzono wagę i wzrost wszystkich ochotników, a następnie obliczano ich wskaźnik masy ciała (BMI) w celu porównania antropometrycznego przed i po operacji bariatrycznej. Masę ciała mierzono za pomocą wagi cyfrowej, a ochotnicy byli ubrani w lekkie ubrania, boso, z pustymi kieszeniami i bez akcesoriów. Wysokość mierzono za pomocą stadiometru z 2-metrową przedłużką. Badani byli boso, z nogami i stopami równolegle, ciężar ciała rozłożony na obie stopy, ramiona rozluźnione wzdłuż ciała i dłonie skierowane w stronę ciała, a głowa ustawiona na płaszczyźnie frankfurckiej.

Procedura chirurgii bariatrycznej

Wszyscy ochotnicy włączeni do tego badania byli operowani techniką chirurgiczną RYGB, wykonywaną przez ten sam zespół chirurgiczny, po ujednoliceniu wielkości pętli pokarmowej (długość 1,20 m) i pętli żółciowo-trzustkowej (długość 1 m). Zespolenie gastrojejunokalibrowano sondą Fouchet 32F, uzyskując średnicę 12 mm.

Metoda analityczna

Stężenie amoksycyliny w osoczu oznaczano ilościowo za pomocą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS) i ekstrakcji ciecz-ciecz.

W celu przygotowania próbki do szklanej probówki dodano 100 µl każdej próbki osocza, 50 µl standardu wewnętrznego (IS) cefaleksyny (2,5 µg/ml) i 500 µl acetonitrylu (100%). Próbki worteksowano (30 sek.) i odwirowano (2000 g x 4 min w temp. 4°C). Fazę organiczną przeniesiono do innej szklanej probówki, do której dodano 500 µl dejonizowanej wody i wytrząsano (10 sek.). Do próbek dodano 10 ml dichlorometanu (100 %), worteksowano (10 s) i odwirowano (2000 g x 4 min w 4 ºC). Fazę organiczną przeniesiono na płytki do PCR z automatycznym wstrzykiwaczem.

System wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) (Agilent, Niemcy) składał się z pompy LC-10AD, automatycznego wstrzykiwacza model CTC HST PAL/110695 i pieca G1316A/DE03018295. Wyekstrahowane roztwory (10 µl) wstrzyknięto do kolumny Inertsil ODS-C18 o wymiarach 150 x 4,6 mm (cząstki 5 µm) utrzymywanej w temperaturze 65 ◦C, a fazą ruchomą był metanol/woda (30/70, v/v) + 0,1 % kwas mrówkowy przy natężeniu przepływu 900 μl/min przy stosunku podziału 1:3. Stosowanym spektrometrem mas był Quattro Micro (Micromass, Manchester, UK) z elektrorozpylaniem w trybie dodatnim dla MRM (Multiple Reaction Monitoring) do monitorowania przejść 366,00 >348,90 i 348,00 >158,00 odpowiednio dla amoksycyliny i cefaleksyny.

Walidację metody przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi walidacji metod bioanalitycznych Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) [22] oraz Brazylijskiej Narodowej Agencji Nadzoru Sanitarnego (ANVISA) [23]. Aby ocenić specyficzność metody, przetestowano osiem różnych pustych partii osocza (4 normalne, 2 zhemolizowane i 2 lipemiczne) pod kątem interferencji przy użyciu proponowanej procedury ekstrakcji oraz warunków chromatograficznych lub spektroskopowych i porównano z tymi uzyskanymi w próbkach przetworzonych z dolna granica oznaczalności (LLOQ). Krzywe kalibracji przygotowano przez oznaczenie standardowych próbek osocza przy ośmiu stężeniach amoksycyliny (20-5000 ng/ml) w trzech powtórzeniach, a liniowość każdej krzywej kalibracji określono przez wykreślenie stosunku powierzchni piku (y) amoksycyliny/IS do wartości nominalnej stężenie analitu. Krzywą kalibracyjną skonstruowano metodą ważonej (1/x) regresji liniowej metodą najmniejszych kwadratów. Dokładność i precyzję testu oceniano w badaniach wewnątrz- i między-testowych. Siedem podwielokrotności LLOQ i każdej próbki osocza kontroli jakości (QC) (60, 850, 2500, 4000 i 12000 ng/ml) analizowano w trzech partiach walidacyjnych w trzech różnych dniach. Precyzje międzydniowe i śróddniowe określono jako współczynnik zmienności, CV (%) = (SD/M) x 100, a dokładność jako procentowy błąd względny, RE (%) = [(E - T)/T] x 100 , gdzie M to średnia, SD to odchylenie standardowe M, E to stężenie określone eksperymentalnie, a T to stężenie teoretyczne. Eksperymenty z efektem matrycy przeprowadzono stosując stosunek między amoksycyliną (60 a 4000 ng/ml) i IS wstrzykniętymi bezpośrednio do fazy ruchomej i roztworów wzorcowych dodanych do ślepych ekstraktów osocza (4 normalne, 2 zhemolizowane i 2 lipemiczne). Każdą próbkę otrzymano za pomocą współczynnika macierzowego znormalizowanego przez IS (MFN) zgodnie z następującym wzorem: MFN = (odpowiedź analitu w matrycy/matryca odpowiedzi wzorca wewnętrznego)/(odpowiedź analitu w roztworze/odpowiedź roztworu wzorca wewnętrznego ). Stabilność Próbki osocza QC (60 i 4000 ng/mL) poddano krótkotrwałym (6,0 h) temperaturze pokojowej, trzem cyklom zamrażania-rozmrażania (-20 do 25°C) i 46,5-godzinnym testom stabilności autosamplera (25°C) w trzech powtórzeniach . Wyniki stabilności porównano z wartościami nominalnymi.

Analiza farmakokinetyczna

Parametry farmakokinetyczne uzyskano na podstawie krzywych stężenia w osoczu w funkcji czasu, analizowanych za pomocą modelu bezkompartmentowego przy użyciu oprogramowania Phoenix WinNonlin®, wersja 5.0 (Pharsight Corp, MoutainView, CA, USA). Wartości maksymalnego stężenia w osoczu (Cmax) i czasu do osiągnięcia Cmax (tmax) uzyskano bezpośrednio z obserwowanych krzywych stężenia w osoczu poszczególnych osób w funkcji czasu. Pole pod krzywą stężenia w osoczu w funkcji czasu od czasu zero do czasu ostatniego mierzalnego stężenia obliczono za pomocą liniowej reguły trapezów. Stałą szybkości eliminacji (ke) uzyskano za pomocą analizy regresji log-liniowej, a okres półtrwania w fazie eliminacji (t1/2) obliczono z równania [t1/2=ln(2)/ke].

Analiza statystyczna

Zmienne ilościowe (ciągłe i dyskretne) zostały wstępnie przeanalizowane testem Kołmogorowa-Smirnowa w celu sprawdzenia normalności rozkładu. Ponieważ wymóg ten został w większości zweryfikowany, dla statystyk opisowych obliczono średnią i odchylenie standardowe (SD). Do statystyk analitycznych zastosowano testy parametryczne.

W celu porównania parametrów farmakokinetycznych otyłych ochotników uzyskanych przed (T0) i po (T2) operacji bariatrycznej zastosowano test t dla sparowanych danych. Określono również średnią różnicę (lub średnią różnic) i odpowiadający im 95% przedział ufności (95% CI). Ponadto obliczono stosunek wartości parametrów zweryfikowanych przed i po operacji bariatrycznej, wyrażony jako średnia geometryczna i jej 95% CI. Stopień i znak korelacji liniowej między dwiema zmiennymi oceniono za pomocą współczynnika korelacji Pearsona z jego 95% przedziałem ufności.

We wszystkich analizach zastosowano testy dwustronne, ustalając poziom istotności na poziomie 0,05. Oprogramowanie GraphPad Prism, wersja 5.00 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA) zostało użyte zarówno do analiz statystycznych, jak i grafiki.