Effetto della chirurgia di riduzione dello stomaco sui parametri dell'amoxicillina

Popolazione di studio

Otto volontari obesi di entrambi i sessi, di età compresa tra i 18 e i 60 anni, sono stati selezionati dal programma di obesità dell'Ospedale Generale Dr. César Cals con indicazione di chirurgia bariatrica sulla base dei criteri stabiliti dal Consiglio medico federale (2015) e che sono stati operati utilizzando la tecnica chirurgica RYGB.

Tutti i soggetti hanno firmato il modulo di consenso informato. Lo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale (IRB) dell'Università Federale del Ceará, accreditato dalla Commissione Nazionale per l'Etica della Ricerca - Consiglio Nazionale della Salute, Ministero della Salute e Comitato Scientifico dell'Ospedale Generale Dr. César Cals. Lo studio è stato condotto secondo i principi etici della Dichiarazione di Helsinki rivista nel 2013 e le linee guida di buona pratica clinica.

Disegno dello studio e campionamento farmacocinetico

Questo studio è stato condotto come studio monocentrico, in aperto, randomizzato, a dose singola con due periodi di trattamento: prima dell'intervento chirurgico (Tempo 0 - T0) e 2 mesi dopo la chirurgia bariatrica (Tempo 2 - T2). In ciascun periodo, i volontari obesi hanno ricevuto una singola dose orale di amoxicillina 500 mg capsule (Amoxil®, GlaxoSmithKline Brazil Ltda.) con 200 ml di acqua dopo un digiuno notturno (circa 8 ore). I soggetti sono rimasti a digiuno fino a 3 ore dopo l'assunzione del farmaco. La restrizione di acqua e cibo è stata mantenuta fino a 3 ore dopo l'assunzione della formulazione. A tutti i soggetti sono stati offerti pasti standard. I volontari che avevano bisogno di usare qualsiasi farmaco (antipertensivi, antidiabetici e altri) sono stati istruiti a usarlo 3 ore dopo l'assunzione di amoxicillina. I campioni di sangue (6 mL) per la determinazione della concentrazione plasmatica di amoxicillina sono stati raccolti tramite un catetere venoso in provette eparinizzate a pre-dose (0 h), 0,33, 0,66, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 6 e 8 h post-dose. I campioni di plasma per l'analisi cromatografica sono stati ottenuti mediante centrifugazione (2000 g x 12 min a 4 ºC) dei campioni di sangue. I campioni di plasma sono stati conservati a -20 °C fino all'analisi.

Parametri antropometrici prima e dopo l'intervento chirurgico

Ad ogni visita (T0 e T2), sono stati misurati il ​​peso e l'altezza di tutti i volontari, seguiti dal calcolo del loro indice di massa corporea (BMI) per il confronto antropometrico prima e dopo la chirurgia bariatrica. Il peso corporeo è stato misurato con una bilancia digitale ei volontari indossavano abiti leggeri, scalzi, con le tasche vuote e senza accessori. L'altezza è stata misurata utilizzando uno stadiometro con estensione di 2 metri. I soggetti erano scalzi, con gambe e piedi paralleli, peso distribuito su entrambi i piedi, braccia rilassate ai lati del corpo e palmi rivolti verso il corpo e testa posizionata sul piano di Francoforte.

Intervento di chirurgia bariatrica

Tutti i volontari inclusi in questo studio sono stati operati utilizzando la tecnica chirurgica RYGB, eseguita dalla stessa équipe chirurgica, seguendo una standardizzazione per le dimensioni dell'ansa alimentare (lunghezza 1,20 m) e dell'ansa biliopancreatica (lunghezza 1 m). La gastrodigiunoanastomosi è stata calibrata da una sonda Fouchet 32F, con un diametro di 12 mm.

Metodo analitico

La concentrazione plasmatica di amoxicillina è stata quantificata mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS) e un'estrazione liquido-liquido.

Per la preparazione del campione, in una provetta di vetro sono stati aggiunti 100 µL di ciascun campione di plasma, 50 µL dello standard interno (IS) cephalexin (2,5 µg/mL) e 500 µL di acetonitrile (100%). I campioni sono stati sottoposti a vortex (30 sec) e centrifugati (2000 g x 4 min a 4 ºC). La fase organica è stata trasferita in un'altra provetta di vetro, a cui sono stati aggiunti 500 µL di acqua deionizzata e vortexata (10 sec). Ai campioni sono stati aggiunti 10 mL di diclorometano (100 %), vortexati (10 sec) e centrifugati (2000 g x 4 min a 4 ºC). La fase organica è stata trasferita alle piastre PCR autoiniettore.

Il sistema di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) (Agilent, Germania) consisteva in una pompa LC-10AD, un autoiniettore modello CTC HST PAL/110695 e un forno G1316A/DE03018295. Le soluzioni estratte (10 µL) sono state iniettate in una colonna Inertsil ODS-C18 da 150 x 4,6 mm (5 μm di particelle) mantenuta a 65 °C e la fase mobile era metanolo/acqua (30/70, v/v) + 0,1 % acido formico a una portata di 900 μL/min con un rapporto di divisione di 1:3. Lo spettrometro di massa utilizzato era un Quattro Micro (Micromass, Manchester, UK) con elettrospray in modalità positiva per MRM (Multiple Reaction Monitoring) per monitorare le transizioni 366.00 >348.90 e 348.00 >158.00 rispettivamente per amoxicillina e cefalexina.

La convalida del metodo è stata eseguita secondo la guida alla convalida del metodo bioanalitico della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti [22] e dell'Agenzia nazionale brasiliana di sorveglianza sanitaria (ANVISA) [23]. Per valutare la specificità del metodo, otto diversi lotti di plasma bianco (4 normali, 2 emolizzati e 2 lipemici) sono stati testati per le sue interferenze utilizzando la procedura di estrazione proposta e le condizioni cromatografiche o spettroscopiche e confrontati con quelli ottenuti nei campioni processati dal limite inferiore di quantificazione (LLOQ). Le curve di calibrazione sono state preparate analizzando campioni di plasma standard a otto concentrazioni di amoxicillina (20-5000 ng/mL) in triplicato e la linearità di ciascuna curva di calibrazione è stata determinata tracciando il rapporto dell'area di picco (y) di amoxicillina/IS rispetto al valore nominale concentrazione di analita. La curva di calibrazione è stata costruita mediante regressione lineare dei minimi quadrati ponderati (1/x). L'accuratezza e la precisione del dosaggio sono state valutate mediante studi intra- e inter-dosaggio. Sette aliquote di LLOQ e ciascun campione di plasma di controllo qualità (QC) (60, 850, 2500, 4000 e 12000 ng/mL) sono state analizzate in tre lotti di convalida in tre giorni diversi. Le precisioni intergiornaliere e infragiornaliere sono state determinate come coefficiente di variazione, CV (%) = (SD/M) x 100 e l'accuratezza come percentuale di errore relativo, RE (%) = [(E - T)/T] x 100 , dove M è la media, DS è la deviazione standard di M, E è la concentrazione determinata sperimentalmente e T è la concentrazione teorica. Gli esperimenti sull'effetto matrice sono stati eseguiti utilizzando il rapporto tra amoxicillina (60 e 4000 ng/mL) e IS iniettato direttamente nella fase mobile e soluzioni standard aggiunte agli estratti di plasma bianco (4 normali, 2 emolizzati e 2 lipemici). Ogni campione è stato ottenuto da un fattore di matrice normalizzato da IS (MFN) secondo la seguente formula: MFN = (risposta dell'analita in matrice/risposta standard interno matrice)/(risposta dell'analita in soluzione/risposta della soluzione standard interno ). I campioni di plasma QC di stabilità (60 e 4000 ng/mL) sono stati sottoposti a test di stabilità a breve termine (6,0 ore) a temperatura ambiente, tre cicli di congelamento-scongelamento (da -20 a 25 °C) e test di stabilità con autocampionatore di 46,5 ore (25 ºC) in triplicato . I risultati di stabilità sono stati confrontati con i valori nominali.

Analisi farmacocinetica

I parametri farmacocinetici sono stati ottenuti sulla base delle curve di concentrazione plasmatica rispetto al tempo analizzate da un modello non compartimentale utilizzando il software Phoenix WinNonlin®, versione 5.0 (Pharsight Corp, MoutainView, CA, USA). I valori per la concentrazione plasmatica massima (Cmax) e il tempo fino alla Cmax (tmax) sono stati ottenuti direttamente dalle curve della concentrazione plasmatica individuale osservata rispetto al tempo. L'area sotto la curva della concentrazione plasmatica rispetto al tempo dal tempo zero al tempo dell'ultima concentrazione quantificabile è stata calcolata mediante la regola trapezoidale lineare. La costante di velocità di eliminazione (ke) è stata ottenuta mediante analisi di regressione log-lineare e l'emivita di eliminazione (t1/2) è stata calcolata con l'equazione [t1/2=ln(2)/ke].

analisi statistica

Le variabili quantitative (continue e discrete) sono state inizialmente analizzate mediante il test di Kolmogorov-Smirnov per verificare la normalità della distribuzione. Poiché questo requisito è stato verificato nella maggior parte dei casi, la media e la deviazione standard (SD) sono state calcolate per le statistiche descrittive. I test parametrici sono stati utilizzati per le statistiche analitiche.

Per confrontare i parametri farmacocinetici dei volontari obesi ottenuti prima (T0) e dopo (T2) chirurgia bariatrica, è stato utilizzato il t-test per i dati appaiati. Sono stati inoltre determinati la differenza media (o media delle differenze) e il rispettivo intervallo di confidenza al 95% (95% CI). Inoltre, è stato calcolato il rapporto tra i valori dei parametri verificati prima e dopo la chirurgia bariatrica, espresso come media geometrica e il suo 95% CI. Il grado e il segno della correlazione lineare tra due variabili sono stati valutati dal coefficiente di correlazione di Pearson, accompagnato dal suo 95% CI.

In tutte le analisi sono stati utilizzati test a due code, stabilendo il livello di significatività a 0,05. Il software GraphPad Prism, versione 5.00 (GraphPad Software, San Diego, California, USA) è stato utilizzato sia per le analisi statistiche che per i grafici.