Diagnoza molekularna idiopatycznych śródmiąższowych zapaleń płuc: badanie prospektywne

Cel badania Jest to prospektywna, obserwacyjna próba mająca na celu zebranie próbek SLB, ekstrakcję RNA, analizę profili transkrypcyjnych za pomocą mikromacierzy oraz walidację wcześniej zidentyfikowanych profili ekspresji genów i poziomów ekspresji poszczególnych genów w odniesieniu do rozpoznania IIP (IPF vs. NSIP), określone w wielodyscyplinarnej dyskusji i dodatkowo potwierdzone późniejszym kursem klinicznym. Nie ma eksperymentalnego leku.

Konkretne cele:

1. Przetestuj i zweryfikuj odtwarzalność profili ekspresji genów IPF i NSIP na transkryptomie uzyskanym z biopsji chirurgicznych płuc (homogenaty płuc), zebranych prospektywnie.
2. Przetestuj profile ekspresji genów, odpowiednio, IPF i NSIP, jako predyktory 3-letniego przeżycia od czasu biopsji. .
3. Zbadaj poziomy ekspresji poszczególnych genów (markery NSIP lub IPF) w homogenatach płuc z SLB za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym, jako czynniki odróżniające IPF od NSIP.

Chociaż diagnoza IPF lub NSIP zostanie ustalona w drodze wielodyscyplinarnej dyskusji, zgodnie z wytycznymi, w celu dalszej walidacji sygnatur genowych i pojedynczych genów jako wiarygodnych czynników odróżniających IPF od NSIP, będziemy prospektywnie śledzić przebieg kliniczny pacjentów przez okres 3 lat, aby upewnić się, że przebieg kliniczny jest zgodny z IPF (gorsze) lub NSIP (lepsze). Średnie przebiegi kliniczne IPF i NSIP są jasno określone na podstawie naszej 6-letniej bazy danych dotyczącej chorób śródmiąższowych płuc.

Ocena oczekiwanych efektów:

1. Definicja rozpoznania IPF vs. NSIP przez MDD wśród respirologów, radiologów klatki piersiowej i patologów płuc, zgodnie z aktualną praktyką kliniczną. Statystyki kappa zostaną również wykorzystane do oceny wpływu diagnostycznego molekularnych technik diagnostycznych.
2. Kompleksowa analiza mikromacierzy wszystkich SLB, w tym analiza istotności mikromacierzy, analiza głównych składowych, klastrowanie hierarchiczne i analiza ścieżki pomysłowości. Odtwarzalność predefiniowanych profili ekspresji genów IPF i NSIP będzie badana na chirurgicznych biopsjach płuc.
3. RT-PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru poziomów ekspresji genów 6 wybranych genów, które mogą różnicować IPF od NSIP.
4. Prospektywna obserwacja przebiegu klinicznego (3 lata) w celu dalszego potwierdzenia trafności diagnostycznej.
5. Badanie mocy predykcyjnej profili ekspresji genów IPF i NSIP (zmienne kategoryczne) oraz poziomu ekspresji 6 wybranych genów (zmienne ciągłe) w kierunku 3-letniego przeżycia od czasu biopsji.
6. Ocena obszaru dokładności diagnostycznej pod krzywą, czułości, swoistości) technik molekularnych, po potwierdzeniu rozpoznania 3-letnim przebiegiem klinicznym po biopsji.

Pacjenci Po wykluczeniu znanych przyczyn (zaburzenia reumatoidalne, ekspozycja zawodowa, środowiskowa lub domowa, leki) zwłóknienia płuc, pacjenci kierowani na SLB w celu wyjaśnienia rozpoznania IIP (IPF vs. NSIP) zostaną włączeni do badania. Poinformowana, pisemna zgoda zostanie uzyskana.

Rejestrowana będzie charakterystyka demograficzna i testy czynnościowe płuc przed SLB. Badanie CT klatki piersiowej o wysokiej rozdzielczości przed SLB będzie brane pod uwagę razem z SLB podczas MDD.

Przechowywanie i przetwarzanie próbek W czasie SLB odpowiednia próbka każdego SLB zostanie szybko zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80ºC do czasu przeprowadzenia ekstrakcji RNA.

Ekstrakcja RNA i analiza mikromacierzy RNA zostanie wyizolowane, oznakowane i poddane hybrydyzacji z zestawem ludzkich genów 1.0 przez London Regional Genomic Centre zgodnie z protokołami producenta (Illumina epicentre ScriptSeq).

Zestawy danych do eksperymentów na mikromacierzach zostaną udostępnione w repozytorium Gene Expression Omnibus.

Do wstępnej analizy zostanie użyte oprogramowanie Partek (St.Louis, MO). Dane na poziomie sondy zostaną wstępnie przetworzone. Obejmuje to solidną, wielomacierzową średnią korekcję tła i normalizację danych, która zostanie przeprowadzona we wszystkich macierzach przy użyciu normalizacji kwantylowej. Dostosowane do tła, znormalizowane wartości zostaną następnie skompilowane lub podsumowane przy użyciu techniki dopracowania mediany, aby wygenerować pojedynczą miarę ekspresji. W ramach eksploracyjnej analizy danych zostanie również przeprowadzone mapowanie analizy głównych składowych oraz analiza współczynnika F (stosunek sygnału do szumu).

Do znaczącej analizy mikromacierzy zostanie użytych 33 297 zestawów sond. Wartość q zostanie przyjęta jako poprawka wielokrotnego porównania i wykorzystana do identyfikacji genów o różnej ekspresji. Wartość q reprezentuje minimalny współczynnik fałszywych odkryć (FDR), przy którym pojedynczy test hipotezy można nazwać znaczącym.

Do hierarchicznego grupowania zostaną użyte Cluster 3.0 i Treeview (laboratorium Eisena, Standford Univ.). Grupowanie bez nadzoru nie uwzględnia żadnych zmiennych eksperymentalnych, takich jak leczenie, fenotyp, tkanka itp. Podczas grupowania.

Analiza ścieżki pomysłowości (IPA) ma fundamentalne znaczenie dla określenia ekspresji genów i interakcji białko-białko w kontekście szlaków metabolicznych lub sygnałowych oraz zrozumienia, w jaki sposób białka działają i tworzą szlaki w kontekście wybranych profili ekspresji. IPA to potężna, wyselekcjonowana baza danych i system analityczny do zrozumienia, w jaki sposób białka współpracują ze sobą, aby wpływać na zmiany komórkowe.

Opublikowano profile ekspresji genów, które należy wziąć pod uwagę do walidacji na SLB (Respiratory Research 2018 15 sierpnia; 19: 153). Sygnatura genowa NSIP składa się z 86 genów, podczas gdy sygnatura genowa IPF składa się z 60 genów. Analiza charakterystyki działania odbiornika zostanie wykorzystana do określenia dokładności analizy ekspresji genów w diagnostyce IPF vs. NSIP (pole pod krzywą, czułość, specyficzność).

RT-PCR Duże białko rybosomalne P0 zostanie użyte jako gen metabolizmu podstawowego. W oparciu o nasze poprzednie wyniki na eksplantatach płuc, 6 genów zostanie przetestowanych jako dyskryminatory IPF vs. NSIP na homogenatach płuc z SLB. Wszystkie geny sprawdzono krzyżowo z normalnymi kontrolami.

Analiza statystyczna Test Kołmogorowa-Smirnowa posłuży do oceny rozkładu zmiennych demograficznych, funkcjonalnych i RT-PCR. Do porównania grup (IPF vs. NSIP) zostanie użyty test t dla nieparzystych lub test Manna-Whitneya, jeśli wskazano. Analiza proporcjonalnego hazardu Coxa i charakterystyka działania odbiornika zostaną wykorzystane do określenia siły zmiennych RT-PCR w przewidywaniu wyniku. Statystyka Kappa zostanie wykorzystana do oceny zgodności diagnostycznej podczas MDD. Analiza charakterystyk pracy odbiornika posłuży do oceny trafności diagnostycznej (czułość, specyficzność, pole pod krzywą).

Definicja rozpoznania i przebieg kliniczny po biopsji Konkretne rozpoznanie IIP (IPF vs. NSIP) zostanie określone na podstawie wielodyscyplinarnej dyskusji (MDD) pomiędzy lekarzem prowadzącym, radiologiem klatki piersiowej i patologiem płuc, biorąc pod uwagę informacje kliniczne tomografia komputerowa klatki piersiowej wzór radiograficzny i wzór patologii widoczny na SLB. Diagnoza zostanie osiągnięta w drodze konsensusu, zgodnie z obecnymi standardami postępowania.

Aby potwierdzić diagnozę, pacjenci będą obserwowani przez okres 3 lat po SLB. Szybkość progresji klinicznej i przeżywalności istotnie różni się w IPF i NSIP.

Postęp kliniczny od momentu rozpoznania (SLB) zostanie zdefiniowany jako: >10% bezwzględne zmniejszenie natężonej pojemności życiowej (FVC) % pred; >50 m spadku w 6-minutowym marszu (6MWD); przyjęcie do szpitala z przyczyn oddechowych; ocena przeszczepu płuc (LTx); lub śmierć.

Wizyty w klinice odbywają się w odstępach 4-6 miesięcy, zgodnie z zaleceniami lekarza. Podczas każdej wizyty zbierane będą dane dotyczące oceny duszności MRC, testów czynnościowych płuc i 6-minutowych testów marszu.