Idiopaattisten interstitiaalisten keuhkokuumeiden molekyylidiagnoosi: tulevaisuuden tutkimus

Tutkimuksen tarkoitus Tämä on tulevaisuuden havainnointikoe SLB-näytteiden keräämiseksi, RNA:n erottamiseksi, transkriptioprofiilien analysoimiseksi mikrosirulla ja aiemmin tunnistettujen geenien ilmentymisprofiilien ja yksittäisten geenien ilmentymistasojen validoimiseksi IIP-diagnoosia vastaan ​​(IPF vs. NSIP). määriteltiin monialaisessa keskustelussa ja vahvistetaan edelleen myöhemmällä kliinisellä kurssilla. Siihen ei liity kokeellista lääkettä.

Erityistavoitteet:

1. Testaa ja validoi IPF:n ja NSIP:n geeniekspressioprofiilien toistettavuus transkriptomissa, jotka on saatu kirurgisista keuhkobiopsioista (keuhkohomogenaatit), jotka on kerätty prospektiivisesti.
2. Testaa IPF:n ja NSIP:n geeniekspressioprofiilit, tässä järjestyksessä, 3 vuoden eloonjäämisen ennustajina biopsiasta lähtien. .
3. Testaa yksittäisiä geenien ilmentymistasoja (NSIP- tai IPF-markkerit) SLB:n keuhkohomogenaateissa reaaliaikaisella RT-PCR:llä IPF:n ja NSIP:n erottelijoina.

Vaikka IPF:n tai NSIP:n diagnoosi vahvistetaan monitieteisellä keskustelulla ohjeiden mukaisesti, jotta geenien allekirjoitukset ja yksittäiset geenit voitaisiin edelleen validoida luotettavina IPF:n ja NSIP:n erottelijoina, seuraamme potilaiden kliinistä kulkua prospektiivisesti. kolmen vuoden ajan varmistaakseen, että kliininen kulku on yhdenmukainen joko IPF:n (huonompi) tai NSIP:n (parempi) kanssa. IPF:n ja NSIP:n keskimääräiset kliiniset kurssit ovat selkeästi vahvistettu 6 vuoden interstitiaalisen keuhkosairaustietokantakokemuksemme perusteella.

Arvio odotetuista tuloksista:

1. MDD:n määrittelemä IPF vs. NSIP diagnoosi hengityselinlääkärin, rintaradiologin ja keuhkosatologin keskuudessa nykyisen kliinisen käytännön mukaisesti. Kappa-tilastoja käytetään myös molekyylidiagnostisten tekniikoiden diagnostisten vaikutusten arvioimiseen.
2. Kaiken SLB:n kattava mikrosiruanalyysi, mukaan lukien mikrosirujen merkitsevyysanalyysi, pääkomponenttianalyysi, hierarkkinen klusterointi ja Ingenuity-polkuanalyysi. IPF:n ja NSIP:n ennalta määritettyjen geeniekspressioprofiilien toistettavuutta tutkitaan kirurgisilla keuhkobiopsioilla.
3. Reaaliaikainen RT-PCR mittaamaan 6 valitun geenin geeniekspressiotasoja, jotka voivat erottaa IPF:n NSIP:stä.
4. Kliinisen kurssin tuleva seuranta (3 vuotta) diagnostisen tarkkuuden vahvistamiseksi.
5. Tutkimus IPF:n ja NSIP:n (kategorialliset muuttujat) geeniekspressioprofiilien ennustevoimasta ja kuuden valitun geenin (jatkuvat muuttujat) ilmentymistasosta kohti 3 vuoden eloonjäämistä biopsiasta alkaen.
6. Diagnostisen tarkkuusalueen arviointi käyrän alla, molekyylitekniikoiden herkkyys, spesifisyys) diagnoosin validoinnin jälkeen 3 vuoden biopsian jälkeisellä kliinisellä kurssilla.

Koehenkilöt Kun keuhkofibroosin tunnetut syyt (reumataudit, työperäiset, ympäristö- tai kotiolot, lääkkeet) on suljettu pois, potilaat, jotka lähetetään SLB:lle IIP-diagnoosin (IPF vs. NSIP) selvittämiseksi, otetaan mukaan tutkimukseen. Tietoinen kirjallinen suostumus hankitaan.

Demografiset ominaisuudet ja keuhkojen toimintatestit ennen SLB:tä tallennetaan. SLB:tä edeltävää korkean resoluution rintakehän CT-skannausta tarkastellaan yhdessä SLB:n kanssa MDD:n aikana.

Näytteiden säilytys ja käsittely SLB:n aikana riittävä näyte jokaisesta SLB:stä pikapakastetaan nestemäisellä typellä ja säilytetään -80 ºC:ssa, kunnes RNA:n uuttaminen jatketaan.

RNA:n uutto ja Microarray-analyysi RNA eristetään, leimataan ja hybridisoidaan ihmisen geeni 1.0 -sarjaan Lontoon alueellisessa genomikeskuksessa valmistajan ohjeiden mukaisesti (Illumina epicenter ScriptSeq).

Datasarjat microarray-kokeita varten ovat saatavilla Gene Expression Omnibus -tietovarastossa.

Alustavassa analyysissä käytetään Partek-ohjelmistoa (St.Louis, MO). Anturitason tiedot esikäsitellään. Tämä sisältää vankan usean taulukon keskimääräisen taustan korjauksen ja tietojen normalisoinnin, joka suoritetaan kaikissa taulukoissa kvantiilinormalisoinnilla. Taustasäädetyt, normalisoidut arvot kootaan sitten tai tehdään yhteenveto käyttämällä mediaanikiillotustekniikkaa, jolloin saadaan yksi ilmaisumitta. Tutkivana data-analyysinä suoritetaan myös pääkomponenttianalyysin kartoitus ja F Ratio -analyysi (signaali-kohinasuhde).

Merkittävään Microarray-analyysiin käytetään 33 297 koetinsarjaa. q-arvo otetaan käyttöön moninkertaisena vertailukorjauksena ja sitä käytetään erilaisesti ilmentyneiden geenien tunnistamiseen. q-arvo edustaa pienintä väärien havaintojen suhdetta (FDR), jolla yksittäistä hypoteesitestiä voidaan kutsua merkitseväksi.

Hierarkkiseen klusterointiin käytetään Cluster 3.0:aa ja Treeviewia (Eisenin laboratorio, Standford Univ.). Valvomaton klusterointi ei ota huomioon mitään kokeellisia muuttujia, kuten hoitoa, fenotyyppiä, kudosta jne., klusteroinnin aikana.

Ingenuity Pathway -analyysillä (IPA) on keskeinen rooli geenin ilmentymisen ja proteiini-proteiini-vuorovaikutusten määrittämisessä aineenvaihdunta- tai signalointireittien yhteydessä ja sen ymmärtämisessä, kuinka proteiinit toimivat ja muodostavat reittejä valittujen ilmentymisprofiilien yhteydessä. IPA on tehokas kuratoitu tietokanta ja analyysijärjestelmä, joka auttaa ymmärtämään, kuinka proteiinit vaikuttavat yhdessä solumuutoksiin.

Geeniekspressioprofiilit, jotka on otettava huomioon SLB:n validoinnissa, julkaistiin (Respiratory Research 2018, 15. elokuuta; 19:153). NSIP:n geeniallekirjoitus koostuu 86 geenistä, kun taas IPF:n geeniallekirjoitus koostuu 60 geenistä. Vastaanottimen toimintaominaisuuksien analyysiä käytetään määrittämään geeniekspressioanalyysin tarkkuus määritettäessä diagnoosi IPF vs. NSIP (käyrän alla oleva pinta-ala, herkkyys, spesifisyys).

RT-PCR Ribosomaalista proteiinia suurta P0:ta käytetään taloudenhoitogeeninä. Aiempien keuhkoeksplantaattituloksiemme perusteella testataan 6 geeniä IPF:n ja NSIP:n erottelijoina SLB:n keuhkojen homogenaateissa. Kaikki geenit ristiintarkastettiin normaaleja kontrolleja vastaan.

Tilastollinen analyysi Kolmogorov-Smirnov-testiä käytetään demografisten, toiminnallisten ja RT-PCR-muuttujien jakautumisen arvioimiseen. Ryhmien vertailuun (IPF vs. NSIP) käytetään joko paritonta t-testiä tai Mann-Whitneyn testiä, jos osoitetaan. Coxin suhteellista vaaraanalyysiä ja vastaanottimen toimintaominaisuuksia käytetään RT-PCR-muuttujien vahvuuden määrittämiseen tulosten ennustamisessa. Kappa-tilastoja käytetään diagnostisen sopimuksen arvioimiseen MDD:n aikana. Vastaanottimen toimintaominaisuuksien analyysiä käytetään diagnostisen tarkkuuden (herkkyys, spesifisyys, käyrän alla oleva pinta-ala) arvioimiseen.

Diagnoosin ja biopsian jälkeisen kliinisen kulun määrittely IIP:n spesifinen diagnoosi (IPF vs. NSIP) määritellään hoitavan lääkärin, keuhkoradiologin ja keuhkopatologin välisen monialaisen keskustelun (MDD) perusteella ottaen huomioon kliiniset tiedot rintakehän CT-skannaus. röntgenkuva ja SLB:ssä havaittu patologinen kuvio. Diagnoosi tehdään konsensuksella nykyisen käytännön mukaisesti.

Diagnoosin vahvistamiseksi potilaita seurataan 3 vuoden ajan SLB:n jälkeen. Kliinisen etenemisen ja eloonjäämisaste eroavat merkittävästi IPF:ssä vs. NSIP:ssä.

Kliininen eteneminen diagnoosihetkestä (SLB) määritellään joko: >10 % absoluuttinen aleneminen pakotetussa vitaalikapasiteetissa (FVC) % pred; >50 m lasku 6 minuutin kävelymatkan päässä (6MWD); sairaalahoitoon hengitysteiden syistä; keuhkonsiirron (LTx) arviointi; tai kuolema.

Klinikkakäynnit tapahtuvat 4-6 kuukauden välein kliinikon sanelemana. Jokaisella käynnillä kerätään MRC hengenahdistuspisteet, keuhkojen toimintatestit ja 6 minuutin kävelytestit.