Diagnóstico Molecular das Pneumonias Intersticiais Idiopáticas: um Estudo Prospectivo

Objetivo do estudo Este é um estudo observacional prospectivo para coletar amostras de SLB, extrair RNA, analisar perfis transcricionais por microarray e validar perfis de expressão gênica previamente identificados e níveis de expressão de genes individuais contra o diagnóstico de IIP (IPF vs. NSIP), definido por discussão multidisciplinar e posteriormente confirmado pelo curso clínico subseqüente. Não há nenhuma droga experimental envolvida.

Objetivos específicos:

1. Testar e validar a reprodutibilidade dos perfis de expressão gênica de IPF e NSIP no transcriptoma obtido de biópsias pulmonares cirúrgicas (homogenados pulmonares), coletados prospectivamente.
2. Testar os perfis de expressão gênica de IPF e NSIP, respectivamente, como preditores de sobrevida de 3 anos a partir do momento da biópsia. .
3. Testar os níveis individuais de expressão gênica (marcadores de NSIP ou IPF) em homogenatos pulmonares de SLB com RT-PCR em tempo real, como discriminadores de IPF vs. NSIP.

Embora o diagnóstico de IPF ou NSIP seja estabelecido por discussão multidisciplinar, de acordo com as diretrizes, a fim de validar ainda mais as assinaturas de genes e genes únicos como discriminadores confiáveis ​​de IPF vs. NSIP, acompanharemos prospectivamente o curso clínico dos pacientes por um período de 3 anos, para garantir que o curso clínico seja consistente com FPI (pior) ou NSIP (melhor). Os cursos clínicos médios de FPI e NSIP são claramente estabelecidos por nossa experiência de banco de dados de doença pulmonar intersticial de 6 anos.

Avaliação dos resultados esperados:

1. Definição de um diagnóstico de FPI vs. NSIP por MDD entre Respirologist, Radiologista Torácico e Patologista Pulmonar, de acordo com a prática clínica atual. A estatística Kappa também será usada para avaliar o impacto diagnóstico das técnicas de diagnóstico molecular.
2. Análise abrangente de microarray de todos os SLB, incluindo análise de significância de microarray, análise de componentes principais, agrupamento hierárquico e análise de caminho do Ingenuity. A reprodutibilidade de perfis de expressão gênica pré-definidos de IPF e NSIP será estudada em biópsias pulmonares cirúrgicas.
3. RT-PCR em tempo real para medir os níveis de expressão gênica de 6 genes selecionados que podem diferenciar IPF de NSIP.
4. Acompanhamento prospectivo do curso clínico (3 anos) para validar ainda mais a precisão diagnóstica.
5. Estudo do poder preditivo dos perfis de expressão gênica de FPI e NSIP (variáveis ​​categóricas) e do nível de expressão de 6 genes selecionados (variáveis ​​contínuas) para sobrevida de 3 anos a partir do momento da biópsia.
6. Avaliação da acurácia diagnóstica área sob a curva, sensibilidade, especificidade) de técnicas moleculares, após validação do diagnóstico com curso clínico pós-biópsia de 3 anos.

Sujeitos Após descartar causas conhecidas (distúrbios reumatóides, exposições ocupacionais, ambientais ou domésticas, drogas) de fibrose pulmonar, os pacientes encaminhados para um SLB para esclarecer o diagnóstico de IIP (IPF vs. NSIP) serão recrutados no estudo. O consentimento informado e por escrito será obtido.

As características demográficas e testes de função pulmonar antes do SLB serão registrados. A tomografia computadorizada de tórax de alta resolução pré-SLB será considerada em conjunto com o SLB durante o MDD.

Armazenamento e processamento das amostras No momento do SLB, uma amostra adequada de cada SLB será congelada rapidamente com nitrogênio líquido e armazenada a -80ºC, até que seja realizada a extração do RNA.

Extração de RNA e análise de Microarray O RNA será isolado, rotulado e hibridizado com o gene humano 1.0 set array pelo London Regional Genomic Centre de acordo com os protocolos do fabricante (Illumina epicenter ScriptSeq).

Conjuntos de dados para experimentos de microarray serão disponibilizados no repositório Gene Expression Omnibus.

O software Partek (St.Louis, MO) será usado para a análise preliminar. Os dados no nível da sonda serão pré-processados. Isso incluirá correção de fundo média multiarray robusta e normalização de dados, que serão executadas em todos os arrays usando normalização quantílica. Os valores normalizados ajustados ao plano de fundo serão então compilados ou resumidos, usando a técnica de polimento mediano, para gerar uma única medida de expressão. Como análise exploratória de dados, também serão realizados mapeamento de análise de componentes principais e análise F Ratio (relação sinal-ruído).

Para Análise Significativa de Microarray, serão utilizados 33.297 conjuntos de sondas. O valor q será adotado como uma correção de comparação múltipla e usado para identificar genes diferencialmente expressos. O valor q representa a taxa de descoberta falsa mínima (FDR) na qual um teste de hipótese individual pode ser considerado significativo.

Para agrupamento hierárquico, Cluster 3.0 e Treeview (laboratório de Eisen, Standford Univ.) serão usados. O agrupamento não supervisionado não leva em consideração nenhuma das variáveis ​​experimentais, como tratamento, fenótipo, tecido, etc., durante o agrupamento.

A análise de Ingenuity Pathway (IPA) é fundamental para determinar a expressão gênica e as interações proteína-proteína no contexto de vias metabólicas ou de sinalização e para entender como as proteínas operam e formam vias, no contexto dos perfis de expressão selecionados. O IPA é um poderoso sistema de análise e banco de dados com curadoria para entender como as proteínas trabalham juntas para efetuar alterações celulares.

Os perfis de expressão gênica a serem considerados para validação no SLB foram publicados (Respiratory Research 2018 Aug 15;19:153). A assinatura gênica de NSIP consiste em 86 genes, enquanto a assinatura gênica de IPF consiste em 60 genes. A análise das características operacionais do receptor será usada para determinar a precisão da análise da expressão gênica na determinação do diagnóstico de IPF vs. NSIP (área sob a curva, sensibilidade, especificidade).

RT-PCR A proteína ribossomal P0 grande será usada como gene de manutenção. Com base em nossos resultados anteriores em explantes de pulmão, 6 genes serão testados como discriminadores de IPF vs. NSIP em homogeneizados de pulmão de SLB. Todos os genes foram cruzados com controles normais.

Análise estatística O teste de Kolmogorov-Smirnov será utilizado para avaliar a distribuição das variáveis ​​demográficas, funcionais e de RT-PCR. Para comparação dos grupos (IPF vs. NSIP), será utilizado o teste t não pareado ou o teste de Mann-Whitney, quando indicado. A análise de risco proporcional de Cox e as características operacionais do receptor serão usadas para determinar a força das variáveis ​​RT-PCR na previsão do resultado. As estatísticas Kappa serão usadas para avaliar a concordância diagnóstica durante MDD. A análise das características operacionais do receptor será usada para avaliar a precisão do diagnóstico (sensibilidade, especificidade, área sob a curva).

Definição do diagnóstico e curso clínico pós-biópsia O diagnóstico específico de IIP (IPF vs. NSIP) será definido com base na discussão multidisciplinar (MDD) entre o médico assistente, o radiologista torácico e o patologista pulmonar, levando em consideração as informações clínicas da tomografia computadorizada do tórax padrão radiográfico e padrão patológico visto no SLB. O diagnóstico será feito por consenso, de acordo com o padrão de prática atual.

Para validar o diagnóstico, os pacientes serão acompanhados por um período de 3 anos após o SLB. A taxa de progressão clínica e a sobrevivência são significativamente diferentes na FPI vs. NSIP.

A progressão clínica a partir do momento do diagnóstico (SLB) será definida como: >10% de redução absoluta na capacidade vital forçada (FVC) % pred; >50 m de declínio na distância de caminhada de 6 minutos (6MWD); internação hospitalar por causas respiratórias; avaliação de transplante pulmonar (LTx); ou morte.

As visitas clínicas ocorrem em intervalos de 4 a 6 meses, conforme ditado pelo médico. Em cada visita, serão coletados dados do escore de dispneia MRC, testes de função pulmonar e testes de caminhada de 6 minutos.