Molekulární diagnostika idiopatických intersticiálních pneumonií: prospektivní studie

Cíl studie Jedná se o prospektivní observační studii s cílem odebrat vzorky SLB, extrahovat RNA, analyzovat transkripční profily pomocí microarray a ověřit dříve identifikované profily genové exprese a úrovně exprese jednotlivých genů proti diagnóze IIP (IPF vs. NSIP), definované multidisciplinární diskusí a dále potvrzené následným klinickým průběhem. Nejedná se o žádný experimentální lék.

Konkrétní cíle:

1. Otestujte a ověřte reprodukovatelnost profilů genové exprese IPF a NSIP na transkriptomu získaném z chirurgických plicních biopsií (plicní homogenáty), prospektivně odebraných.
2. Otestujte profily genové exprese IPF a NSIP jako prediktorů 3letého přežití od doby biopsie. .
3. Testujte jednotlivé úrovně genové exprese (markery NSIP nebo IPF) v plicních homogenátech ze SLB pomocí RT-PCR v reálném čase jako diskriminátorů IPF vs. NSIP.

Ačkoli diagnóza IPF nebo NSIP bude stanovena multidisciplinární diskusí, podle pokynů, abychom mohli dále validovat genové signatury a jednotlivé geny jako spolehlivé diskriminátory IPF vs. NSIP, budeme prospektivně sledovat klinický průběh pacientů po dobu po dobu 3 let, aby se zajistilo, že klinický průběh odpovídá IPF (horší) nebo NSIP (lepší). Průměrné klinické průběhy IPF a NSIP jsou jasně stanoveny naší 6letou zkušeností s databází intersticiálních plicních onemocnění.

Posouzení očekávaných výsledků:

1. Definice diagnózy IPF vs. NSIP podle MDD mezi respirologem, hrudním radiologem a plicním patologem podle současné klinické praxe. Kappa statistika bude také použita pro hodnocení diagnostického dopadu molekulárních diagnostických technik.
2. Komplexní microarray analýza všech SLB, včetně analýzy významnosti microarray, analýzy hlavních komponent, hierarchického shlukování a analýzy Ingenuity pathway. Reprodukovatelnost předem definovaných profilů genové exprese IPF a NSIP bude studována na chirurgických plicních biopsiích.
3. RT-PCR v reálném čase k měření hladin genové exprese 6 vybraných genů, které mohou odlišit IPF od NSIP.
4. Prospektivní sledování klinického průběhu (3 roky) k dalšímu ověření diagnostické přesnosti.
5. Studium prediktivní síly profilů genové exprese IPF a NSIP (kategoriální proměnné) a úrovně exprese 6 vybraných genů (kontinuální proměnné) směrem k 3letému přežití od doby biopsie.
6. Posouzení diagnostické přesnosti oblasti pod křivkou, citlivosti, specificity) molekulárních technik po validaci diagnózy s 3letým postbioptickým klinickým průběhem.

Subjekty Po vyloučení známých příčin (revmatoidní poruchy, pracovní, environmentální nebo domácí expozice, drogy) plicní fibrózy budou do studie zařazeni pacienti, kteří byli odesláni na SLB k objasnění diagnózy IIP (IPF vs. NSIP). Bude získán informovaný písemný souhlas.

Budou zaznamenány demografické charakteristiky a testy plicních funkcí před SLB. CT hrudníku s vysokým rozlišením před SLB bude zvažováno společně s SLB během MDD.

Skladování a zpracování vzorků V době SLB bude adekvátní vzorek každého SLB rychle zmrazen tekutým dusíkem a skladován při -80ºC, dokud nebude provedena extrakce RNA.

Extrakce RNA a analýza Microarray RNA bude izolována, značena a hybridizována na sadu lidských genů 1.0 v London Regional Genomic Center podle protokolů výrobce (Illumina epicenter ScriptSeq).

Soubory dat pro experimenty s mikročipy budou zpřístupněny v úložišti Gene Expression Omnibus.

Pro předběžnou analýzu bude použit software Partek (St.Louis, MO). Data na úrovni sondy budou předzpracována. To bude zahrnovat robustní multi-array průměrnou korekci pozadí a normalizaci dat, která bude provedena napříč všemi poli pomocí kvantilové normalizace. Normalizované hodnoty upravené na pozadí pak budou sestaveny nebo shrnuty pomocí techniky středního lesku, aby se vytvořila jediná míra vyjádření. Jako průzkumná analýza dat bude také provedeno mapování analýzy hlavních komponent a analýza F Ratio (poměr signálu k šumu).

Pro významnou analýzu Microarray bude použito 33 297 sad sond. Hodnota q bude přijata jako korekce vícenásobného srovnání a použita k identifikaci odlišně exprimovaných genů. Hodnota q představuje minimální poměr falešných objevů (FDR), při kterém lze individuální test hypotézy označit za významný.

Pro hierarchické shlukování budou použity Cluster 3.0 a Treeview (Eisenova laboratoř, Standford Univ.). Shlukování bez dozoru nebere při shlukování v úvahu žádné z experimentálních proměnných, jako je léčba, fenotyp, tkáň atd.

Analýza cesty vynalézavosti (IPA) je základní úlohou pro stanovení genové exprese a interakcí protein-protein v kontextu metabolických nebo signálních drah a pro pochopení toho, jak proteiny fungují a tvoří dráhy, v kontextu vybraných expresních profilů. IPA je výkonný kurátorský databázový a analytický systém pro pochopení toho, jak proteiny spolupracují při ovlivnění buněčných změn.

Byly zveřejněny profily genové exprese, které je třeba vzít v úvahu pro validaci na SLB (Respiratory Research 2018 Aug 15;19:153). Genová signatura NSIP se skládá z 86 genů, zatímco genová signatura IPF se skládá z 60 genů. Analýza provozních charakteristik přijímače bude použita ke stanovení přesnosti analýzy genové exprese při stanovení diagnózy IPF vs. NSIP (plocha pod křivkou, senzitivita, specificita).

RT-PCR Ribozomální protein velký P0 bude použit jako provozní gen. Na základě našich předchozích výsledků na plicních explantátech bude testováno 6 genů jako diskriminátorů IPF vs. NSIP na plicních homogenátech ze SLB. Všechny geny byly křížově zkontrolovány proti normálním kontrolám.

Statistická analýza K posouzení distribuce demografických, funkčních a RT-PCR proměnných bude použit Kolmogorov-Smirnovův test. Pro srovnání skupin (IPF vs. NSIP) bude použit buď nepárový t-test, nebo Mann-Whitney test, kde je uvedeno. Coxova proporcionální analýza rizik a provozní charakteristiky přijímače budou použity k určení síly proměnných RT-PCR při předpovídání výsledku. Kappa statistika bude použita k posouzení diagnostické shody během MDD. Analýza provozních charakteristik přijímače bude použita pro posouzení diagnostické přesnosti (senzitivita, specificita, plocha pod křivkou).

Definice diagnózy a postbioptický klinický průběh Konkrétní diagnóza IIP (IPF vs. NSIP) bude definována na základě multidisciplinární diskuse (MDD) mezi ošetřujícím lékařem, radiologem hrudníku a plicním patologem s přihlédnutím ke klinickým informacím CT hrudníku rentgenový vzor a patologický vzor pozorovaný na SLB. Diagnóza bude dosažena na základě konsenzu podle současného standardu praxe.

Pro potvrzení diagnózy budou pacienti sledováni po dobu 3 let po SLB. Rychlost klinické progrese a přežití se významně liší u IPF vs. NSIP.

Klinická progrese od okamžiku diagnózy (SLB) bude definována buď jako: >10% absolutní snížení usilovné vitální kapacity (FVC) % před; >50 m pokles ve vzdálenosti 6 minut chůze (6MWD); přijetí do nemocnice z respiračních příčin; hodnocení transplantace plic (LTx); nebo smrt.

Návštěvy na klinice se konají ve 4-6měsíčních intervalech, jak stanoví lékař. Při každé návštěvě budou shromážděny údaje o skóre dušnosti MRC, testech funkce plic a 6minutových testech chůze.