Molekulare Diagnose idiopathischer interstitieller Pneumonien: eine prospektive Studie

Ziel der Studie Dies ist eine prospektive Beobachtungsstudie zur Sammlung von Proben von SLB, zur Extraktion von RNA, zur Analyse von Transkriptionsprofilen durch Microarray und zur Validierung zuvor identifizierter Genexpressionsprofile und individueller Genexpressionsniveaus gegen die Diagnose von IIP (IPF vs. NSIP). durch multidisziplinäre Diskussion definiert und durch den anschließenden klinischen Verlauf weiter bestätigt. Es ist kein experimentelles Medikament beteiligt.

Bestimmte Ziele:

1. Testen und validieren Sie die Reproduzierbarkeit von Genexpressionsprofilen von IPF und NSIP auf dem Transkriptom, das aus prospektiv gesammelten chirurgischen Lungenbiopsien (Lungenhomogenaten) gewonnen wurde.
2. Testen Sie die Genexpressionsprofile von IPF bzw. NSIP als Prädiktoren für das 3-Jahres-Überleben ab dem Zeitpunkt der Biopsie. .
3. Testen Sie einzelne Genexpressionsniveaus (Marker von NSIP oder IPF) in Lungenhomogenaten von SLB mit Echtzeit-RT-PCR als Unterscheidungsmerkmale von IPF vs. NSIP.

Obwohl die Diagnose von IPF oder NSIP gemäß den Richtlinien durch multidisziplinäre Diskussion gestellt wird, um Gensignaturen und einzelne Gene als zuverlässige Unterscheidungsmerkmale von IPF vs. NSIP weiter zu validieren, werden wir prospektiv den klinischen Verlauf der Patienten für a Zeitraum von 3 Jahren, um sicherzustellen, dass der klinische Verlauf entweder IPF (schlechter) oder NSIP (besser) entspricht. Die durchschnittlichen klinischen Verläufe von IPF und NSIP sind durch unsere 6-jährige Erfahrung in der Datenbank für interstitielle Lungenerkrankungen eindeutig festgelegt.

Bewertung der erwarteten Ergebnisse:

1. Definition einer Diagnose von IPF vs. NSIP durch MDD unter Respirologen, Thoraxradiologen und Lungenpathologen gemäß der aktuellen klinischen Praxis. Die Kappa-Statistik wird auch verwendet, um die diagnostische Wirkung molekulardiagnostischer Techniken zu bewerten.
2. Umfassende Microarray-Analyse aller SLB, einschließlich Signifikanzanalyse von Microarray, Hauptkomponentenanalyse, hierarchischem Clustering und Ingenuity-Pathway-Analyse. Die Reproduzierbarkeit vordefinierter Genexpressionsprofile von IPF und NSIP wird an chirurgischen Lungenbiopsien untersucht.
3. Echtzeit-RT-PCR zur Messung der Genexpressionsniveaus von 6 ausgewählten Genen, die IPF von NSIP unterscheiden können.
4. Prospektives Follow-up des klinischen Verlaufs (3 Jahre) zur weiteren Validierung der diagnostischen Genauigkeit.
5. Untersuchung der Vorhersagekraft von Genexpressionsprofilen von IPF und NSIP (kategorische Variablen) und des Expressionsniveaus von 6 ausgewählten Genen (kontinuierliche Variablen) in Bezug auf das 3-Jahres-Überleben ab dem Zeitpunkt der Biopsie.
6. Bewertung der diagnostischen Genauigkeit (Fläche unter der Kurve, Sensitivität, Spezifität) molekularer Techniken, nach Validierung der Diagnose mit 3-jährigem klinischem Verlauf nach der Biopsie.

Probanden Nach Ausschluss bekannter Ursachen (rheumatoide Erkrankungen, berufliche, umweltbedingte oder häusliche Exposition, Medikamente) der Lungenfibrose werden Patienten, die zur Abklärung der IIP-Diagnose (IPF vs. NSIP) an eine SLB überwiesen werden, in die Studie aufgenommen. Informierte, schriftliche Zustimmung wird eingeholt.

Demografische Merkmale und Lungenfunktionstests vor dem SLB werden erfasst. Der hochauflösende Brust-CT-Scan vor dem SLB wird zusammen mit dem SLB während der MDD betrachtet.

Lagerung und Verarbeitung von Proben Zum Zeitpunkt des SLB wird eine angemessene Probe jedes SLB mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert, bis die RNA-Extraktion fortgesetzt wird.

RNA-Extraktion und Microarray-Analyse RNA wird gemäß den Protokollen des Herstellers (Illumina epicenter ScriptSeq) vom London Regional Genomic Centre isoliert, markiert und mit dem Human Gene 1.0 Set Array hybridisiert.

Datensätze für Microarray-Experimente werden im Gene Expression Omnibus-Repository zur Verfügung gestellt.

Die Partek-Software (St.Louis, MO) wird für die vorläufige Analyse verwendet. Daten auf Sondenebene werden vorverarbeitet. Dazu gehören eine robuste Multi-Array-Durchschnittshintergrundkorrektur und Datennormalisierung, die über alle Arrays hinweg unter Verwendung von Quantil-Normalisierung durchgeführt werden. Hintergrundbereinigte, normalisierte Werte werden dann unter Verwendung der Median-Polish-Technik kompiliert oder zusammengefasst, um ein einziges Expressionsmaß zu erzeugen. Als explorative Datenanalyse werden auch Hauptkomponentenanalyse-Mapping und F-Ratio-Analyse (Signal-Rausch-Verhältnis) durchgeführt.

Für eine signifikante Analyse von Microarray werden 33.297 Sondensätze verwendet. Der q-Wert wird als Mehrfachvergleichskorrektur angenommen und verwendet, um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Der q-Wert stellt die minimale False Discovery Ratio (FDR) dar, bei der ein einzelner Hypothesentest als signifikant bezeichnet werden kann.

Für hierarchisches Clustering werden Cluster 3.0 und Treeview (Eisen's Laboratory, Standford Univ.) verwendet. Beim unüberwachten Clustering werden keine der experimentellen Variablen wie Behandlung, Phänotyp, Gewebe usw. beim Clustering berücksichtigt.

Die Ingenuity Pathway Analysis (IPA) spielt eine grundlegende Rolle, um die Genexpression und Protein-Protein-Interaktionen im Kontext von Stoffwechsel- oder Signalwegen zu bestimmen und zu verstehen, wie Proteine ​​funktionieren und Wege bilden, im Kontext der ausgewählten Expressionsprofile. IPA ist eine leistungsstarke kuratierte Datenbank und ein Analysesystem, um zu verstehen, wie Proteine ​​zusammenarbeiten, um zelluläre Veränderungen zu bewirken.

Genexpressionsprofile, die für die Validierung bei SLB zu berücksichtigen sind, wurden veröffentlicht (Respiratory Research 2018 Aug 15;19:153). Die Gensignatur von NSIP besteht aus 86 Genen, während die Gensignatur von IPF aus 60 Genen besteht. Die Analyse der Betriebseigenschaften des Empfängers wird verwendet, um die Genauigkeit der Genexpressionsanalyse bei der Bestimmung der Diagnose von IPF vs. NSIP (Fläche unter der Kurve, Sensitivität, Spezifität) zu bestimmen.

RT-PCR Ribosomal protein large P0 wird als Housekeeping-Gen verwendet. Basierend auf unseren früheren Ergebnissen an Lungenexplantaten werden 6 Gene als Diskriminatoren von IPF vs. NSIP an Lungenhomogenaten von SLB getestet. Alle Gene wurden gegen normale Kontrollen überprüft.

Statistische Analyse Der Kolmogorov-Smirnov-Test wird verwendet, um die Verteilung der demografischen, funktionellen und RT-PCR-Variablen zu bewerten. Für den Vergleich der Gruppen (IPF vs. NSIP) wird entweder der ungepaarte t-Test oder der Mann-Whitney-Test, wo angegeben, verwendet. Die Cox-Proportional-Hazard-Analyse und die Betriebseigenschaften des Empfängers werden verwendet, um die Stärke der RT-PCR-Variablen bei der Vorhersage des Ergebnisses zu bestimmen. Kappa-Statistiken werden verwendet, um die diagnostische Übereinstimmung während der MDD zu beurteilen. Die Analyse der Betriebseigenschaften des Empfängers wird verwendet, um die diagnostische Genauigkeit (Empfindlichkeit, Spezifität, Fläche unter der Kurve) zu beurteilen.

Definition der Diagnose und klinischer Verlauf nach der Biopsie Die spezifische Diagnose von IIP (IPF vs. NSIP) wird auf der Grundlage einer multidisziplinären Diskussion (MDD) zwischen behandelndem Arzt, Thoraxradiologen und Lungenpathologen unter Berücksichtigung der klinischen Informationen des Thorax-CT-Scans definiert röntgenologisches Muster und pathologisches Muster, das auf dem SLB zu sehen ist. Die Diagnose wird nach aktuellem Praxisstandard im Konsens gestellt.

Um die Diagnose zu validieren, werden die Patienten nach dem SLB für einen Zeitraum von 3 Jahren nachbeobachtet. Die Rate der klinischen Progression und das Überleben unterscheiden sich signifikant bei IPF vs. NSIP.

Klinische Progression ab dem Zeitpunkt der Diagnose (SLB) wird definiert als: >10 % absolute Reduktion der forcierten Vitalkapazität (FVC) % pred; >50 m Gefälle in 6-minütiger Gehentfernung (6MWD); Einweisung ins Krankenhaus aus respiratorischen Gründen; Bewertung der Lungentransplantation (LTx); oder Tod.

Klinikbesuche finden in Abständen von 4-6 Monaten statt, wie vom Kliniker vorgeschrieben. Bei jedem Besuch werden MRC-Dyspnoe-Score, Lungenfunktionstests und 6-Minuten-Gehtestdaten gesammelt.