Molekylær diagnose av idiopatisk interstitiell lungebetennelse: en prospektiv studie

Målet med studien Dette er en prospektiv, observasjonsstudie for å samle inn prøver av SLB, ekstrahere RNA, analysere transkripsjonelle profiler ved hjelp av mikroarray og validere tidligere identifiserte genekspresjonsprofiler og individuelle geners ekspresjonsnivåer mot diagnosen IIP (IPF vs. NSIP), definert ved tverrfaglig diskusjon, og ytterligere bekreftet av påfølgende klinisk kurs. Det er ikke noe eksperimentelt medikament involvert.

Spesifikke mål:

1. Test og valider reproduserbarheten til genekspresjonsprofiler for IPF og NSIP på transkriptomet hentet fra kirurgiske lungebiopsier (lungehomogenater), prospektivt samlet.
2. Test genekspresjonsprofilene til henholdsvis IPF og NSIP som prediktorer for 3-års overlevelse fra tidspunktet for biopsi. .
3. Test individuelle genekspresjonsnivåer (markører for NSIP eller IPF) i lungehomogenater fra SLB med sanntids RT-PCR, som diskriminatorer av IPF vs. NSIP.

Selv om diagnosen IPF eller NSIP vil bli etablert ved tverrfaglig diskusjon, i henhold til retningslinjer, for ytterligere å validere gensignaturer og single gener som pålitelige diskriminatorer av IPF vs. NSIP, vil vi prospektivt følge det kliniske forløpet til pasienter i en periode på 3 år, for å sikre at det kliniske forløpet stemmer overens med enten IPF (verre) eller NSIP (bedre). De gjennomsnittlige kliniske kursene for IPF og NSIP er tydelig etablert av vår 6-årige erfaring fra databasen med interstitielle lungesykdommer.

Vurdering av forventede resultater:

1. Definisjon av en diagnose av IPF vs. NSIP av MDD blant respirolog, brystradiolog og lungepatolog, i henhold til gjeldende klinisk praksis. Kappa-statistikk vil også bli brukt til å evaluere den diagnostiske virkningen av molekylære diagnostiske teknikker.
2. Omfattende mikroarray-analyse av alle SLB, inkludert signifikansanalyse av mikroarray, hovedkomponentanalyse, hierarkisk clustering og Ingenuity pathway-analyse. Reproduserbarheten til forhåndsdefinerte genekspresjonsprofiler av IPF og NSIP vil bli studert på kirurgiske lungebiopsier.
3. Sanntids RT-PCR for å måle genekspresjonsnivåene til 6 utvalgte gener som kan skille IPF fra NSIP.
4. Prospektiv oppfølging av klinisk forløp (3 år) for ytterligere å validere diagnostisk nøyaktighet.
5. Studie av prediksjonskraften til genekspresjonsprofiler for IPF og NSIP (kategoriske variabler) og av ekspresjonsnivået til 6 utvalgte gener (kontinuerlige variabler) mot 3-års overlevelse fra tidspunktet for biopsi.
6. Vurdering av diagnostisk nøyaktighet område under kurven, sensitivitet, spesifisitet) av molekylære teknikker, etter validering av diagnose med 3-årig post-biopsi klinisk forløp.

Forsøkspersoner Etter å ha utelukket kjente årsaker (revmatoide lidelser, yrkesmessige, miljømessige eller innenlandske eksponeringer, medikamenter) til lungefibrose, vil pasienter som blir henvist til en SLB for å avklare diagnosen IIP (IPF vs. NSIP) rekrutteres i studien. Informert, skriftlig samtykke vil bli innhentet.

Demografiske karakteristika og lungefunksjonstester før SLB vil bli registrert. Pre-SLB høyoppløselig CT-skanning av brystet vil bli vurdert sammen med SLB under MDD.

Lagring og behandling av prøver På tidspunktet for SLB vil en tilstrekkelig prøve av hver SLB bli hurtigfryst med flytende nitrogen og lagret ved -80ºC, inntil RNA-ekstraksjon fortsetter.

RNA-ekstraksjon og Microarray-analyse RNA vil bli isolert, merket og hybridisert til det humane gen 1.0-settet av London Regional Genomic Centre i henhold til produsentens protokoller (Illumina epicenter ScriptSeq).

Datasett for mikroarray-eksperimenter vil bli gjort tilgjengelig på Gene Expression Omnibus-depotet.

Partek programvare (St.Louis, MO) vil bli brukt for den foreløpige analysen. Data på sondenivå vil bli forhåndsbehandlet. Dette vil inkludere robust multi-array gjennomsnittlig bakgrunnskorreksjon og datanormalisering, som vil bli utført på tvers av alle arrays ved bruk av kvantilnormalisering. Bakgrunnsjusterte, normaliserte verdier vil deretter bli kompilert, eller oppsummert, ved bruk av median polish-teknikken, for å generere et enkelt mål på uttrykk. Som en utforskende dataanalyse vil også kartlegging av hovedkomponentanalyse og F-forholdsanalyse (signal-til-støy-forhold) utføres.

For signifikant analyse av Microarray vil 33 297 probesett bli brukt. q-verdien vil bli tatt i bruk som en multippel sammenligningskorreksjon og brukt til å identifisere differensielt uttrykte gener. q-verdien representerer det minimale falske oppdagelsesforholdet (FDR) som en individuell hypotesetest kan kalles signifikant.

For hierarkisk clustering vil Cluster 3.0 og Treeview (Eisens laboratorium, Standford Univ.) brukes. Uovervåket klynging tar ikke hensyn til noen av de eksperimentelle variablene som behandling, fenotype, vev, etc. under klynging.

Ingenuity Pathway-analyse (IPA) er grunnleggende rolle for å bestemme genuttrykk og protein-protein-interaksjoner innenfor konteksten av metabolske eller signalveier, og for å forstå hvordan proteiner fungerer og danner veier, i sammenheng med de valgte ekspresjonsprofilene. IPA er en kraftig kuratert database og analysesystem for å forstå hvordan proteiner fungerer sammen for å bevirke cellulære endringer.

Genekspresjonsprofiler som skal vurderes for validering på SLB ble publisert (Respiratory Research 2018 Aug 15;19:153). Gensignaturen til NSIP består av 86 gener, mens gensignaturen til IPF består av 60 gener. Analyse av mottakerdriftskarakteristikk vil bli brukt til å bestemme nøyaktigheten av genekspresjonsanalyse for å bestemme diagnosen IPF vs. NSIP (område under kurven, sensitivitet, spesifisitet).

RT-PCR Ribosomalt protein stort P0 vil bli brukt som husholdningsgen. Basert på våre tidligere resultater på lungeeksplantater, vil 6 gener bli testet som diskriminatorer av IPF vs. NSIP på lungehomogenater fra SLB. Alle gener ble krysssjekket mot normale kontroller.

Statistisk analyse Kolmogorov-Smirnov-testen vil bli brukt til å vurdere distribusjon av demografiske, funksjonelle og RT-PCR-variabler. For sammenligning av grupper (IPF vs. NSIP), vil enten uparet t-test eller Mann-Whitney-testen, der det er indikert, brukes. Cox proporsjonal fareanalyse og mottakerdriftskarakteristikker vil bli brukt for å bestemme styrken til RT-PCR-variabler for å forutsi utfall. Kappa-statistikk vil bli brukt til å vurdere diagnostisk enighet under MDD. Analyse av mottakerdriftskarakteristikk vil bli brukt for å vurdere diagnostisk nøyaktighet (sensitivitet, spesifisitet, areal under kurven).

Definisjon av diagnose og klinisk forløp etter biopsi Den spesifikke diagnosen IIP (IPF vs. NSIP) vil bli definert basert på multidisiplinær diskusjon (MDD) mellom behandlende kliniker, thoraxradiolog og lungepatolog, tatt i betraktning klinisk informasjon CT-skanning av brystet radiografisk mønster og patologimønster sett på SLB. Diagnosen vil bli oppnådd ved konsensus, i henhold til gjeldende praksis.

For å validere diagnosen vil pasientene følges i en periode på 3 år etter SLB. Raten for klinisk progresjon og overlevelse er signifikant forskjellig i IPF vs. NSIP.

Klinisk progresjon fra diagnosetidspunktet (SLB) vil bli definert som enten: >10 % absolutt reduksjon i forsert vitalkapasitet (FVC) % pred; >50 m nedgang i 6-minutters gangavstand (6MWD); innleggelse på sykehus for respiratoriske årsaker; vurdering av lungetransplantasjon (LTx); eller død.

Klinikkbesøk finner sted med 4-6 måneders mellomrom, som diktert av klinikeren. Ved hvert besøk vil MRC-dyspné-score, lungefunksjonstester og 6-minutters gangtester samles inn.