Molekylær diagnose af idiopatiske interstitielle lungebetændelser: en prospektiv undersøgelse

Formålet med undersøgelsen Dette er et prospektivt, observationsforsøg til at indsamle prøver af SLB, ekstrahere RNA, analysere transkriptionelle profiler ved hjælp af mikroarray og validere tidligere identificerede genekspressionsprofiler og individuelle geners ekspressionsniveauer mod diagnosen IIP (IPF vs. NSIP), defineret ved tværfaglig diskussion, og yderligere bekræftet af efterfølgende kliniske forløb. Der er ikke noget eksperimentelt lægemiddel involveret.

Specifikke mål:

1. Test og valider reproducerbarheden af ​​genekspressionsprofiler for IPF og NSIP på transkriptomet opnået fra kirurgiske lungebiopsier (lungehomogenater), prospektivt indsamlet.
2. Test genekspressionsprofilerne for henholdsvis IPF og NSIP som forudsigere for 3-års overlevelse fra tidspunktet for biopsi. .
3. Test individuelle genekspressionsniveauer (markører for NSIP eller IPF) i lungehomogenater fra SLB med real-time RT-PCR, som diskriminatorer af IPF vs. NSIP.

Selvom diagnosen IPF eller NSIP vil blive etableret ved tværfaglig diskussion, i henhold til retningslinjer, for yderligere at validere gensignaturer og singlegener som pålidelige diskriminatorer af IPF vs. NSIP, vil vi prospektivt følge patienternes kliniske forløb i en periode på 3 år, for at sikre, at det kliniske forløb stemmer overens med enten IPF (værre) eller NSIP (bedre). De gennemsnitlige kliniske forløb for IPF og NSIP er klart fastlagt af vores 6-årige erfaring med databaser med interstitielle lungesygdomme.

Vurdering af forventede resultater:

1. Definition af en diagnose af IPF vs. NSIP af MDD blandt respirolog, thoraxradiolog og lungepatolog i henhold til gældende klinisk praksis. Kappa-statistikker vil også blive brugt til at evaluere den diagnostiske virkning af molekylære diagnostiske teknikker.
2. Omfattende mikroarray-analyse af alle SLB, herunder signifikansanalyse af mikroarray, principal komponentanalyse, hierarkisk clustering og opfindsomhed pathway-analyse. Reproducerbarheden af ​​foruddefinerede genekspressionsprofiler for IPF og NSIP vil blive undersøgt på kirurgiske lungebiopsier.
3. Real-time RT-PCR til måling af genekspressionsniveauer af 6 udvalgte gener, der kan differentiere IPF fra NSIP.
4. Prospektiv opfølgning af klinisk forløb (3 år) for yderligere at validere diagnostisk nøjagtighed.
5. Undersøgelse af prædiktivkraften af ​​genekspressionsprofiler for IPF og NSIP (kategoriske variabler) og af ekspressionsniveauet af 6 udvalgte gener (kontinuerlige variabler) frem mod 3-års overlevelse fra tidspunktet for biopsi.
6. Vurdering af diagnostisk nøjagtighed område under kurven, sensitivitet, specificitet) af molekylære teknikker, efter validering af diagnose med 3-årig post-biopsi klinisk forløb.

Forsøgspersoner Efter at have udelukket kendte årsager (reumatoide lidelser, erhvervsmæssig, miljømæssig eller huslig eksponering, medicin) til lungefibrose, vil patienter, der henvises til en SLB for at afklare diagnosen IIP (IPF vs. NSIP), blive rekrutteret i undersøgelsen. Der vil blive indhentet skriftligt samtykke.

Demografiske karakteristika og lungefunktionstest før SLB vil blive registreret. Pre-SLB højopløsnings CT-scanning af brystet vil blive overvejet sammen med SLB under MDD.

Opbevaring og behandling af prøver På tidspunktet for SLB vil en passende prøve af hver SLB blive lynfrosset med flydende nitrogen og opbevaret ved -80ºC, indtil RNA-ekstraktion fortsættes.

RNA-ekstraktion og Microarray-analyse RNA vil blive isoleret, mærket og hybridiseret til det humane gen 1.0 sæt array af London Regional Genomic Centre i henhold til producentens protokoller (Illumina epicenter ScriptSeq).

Datasæt til mikroarray-eksperimenter vil blive gjort tilgængelige på Gene Expression Omnibus-depotet.

Partek software (St.Louis, MO) vil blive brugt til den foreløbige analyse. Data på sondeniveau vil blive forbehandlet. Dette vil omfatte robust multi-array gennemsnitlig baggrundskorrektion og datanormalisering, som vil blive udført på tværs af alle arrays ved hjælp af kvantilnormalisering. Baggrundsjusterede, normaliserede værdier vil derefter blive kompileret eller opsummeret ved hjælp af median polish-teknikken for at generere et enkelt mål for udtryk. Som en eksplorativ dataanalyse vil der også blive udført hovedkomponentanalysekortlægning og F-forholdsanalyse (signal-til-støj-forhold).

Til signifikant analyse af Microarray vil der blive brugt 33.297 probesæt. q-værdien vil blive vedtaget som en multiple sammenligningskorrektion og brugt til at identificere differentielt udtrykte gener. q-værdien repræsenterer det minimale falske opdagelsesforhold (FDR), hvor en individuel hypotesetest kan kaldes signifikant.

Til hierarkisk clustering vil Cluster 3.0 og Treeview (Eisens laboratorium, Standford Univ.) blive brugt. Uovervåget klyngedannelse tager ikke højde for nogen af ​​de eksperimentelle variable, såsom behandling, fænotype, væv osv. under klyngning.

Opfindsomhed Pathway-analyse (IPA) er en fundamental rolle for at bestemme genekspression og protein-protein-interaktioner inden for konteksten af ​​metaboliske eller signalveje, og for at forstå, hvordan proteiner fungerer og danner veje i sammenhæng med de udvalgte ekspressionsprofiler. IPA er en kraftfuld kurateret database og analysesystem til at forstå, hvordan proteiner arbejder sammen for at bevirke cellulære ændringer.

Genekspressionsprofiler, der skal overvejes til validering på SLB, blev offentliggjort (Respiratory Research 2018 Aug 15;19:153). Gensignaturen for NSIP består af 86 gener, mens gensignaturen for IPF består af 60 gener. Analyse af modtagerdriftskarakteristika vil blive brugt til at bestemme nøjagtigheden af ​​genekspressionsanalyse ved bestemmelse af diagnosen IPF vs. NSIP (område under kurven, sensitivitet, specificitet).

RT-PCR Ribosomalt protein stort P0 vil blive brugt som husholdningsgen. Baseret på vores tidligere resultater på lungeeksplantater vil 6 gener blive testet som diskriminatorer af IPF vs. NSIP på lungehomogenater fra SLB. Alle gener blev krydstjekket mod normale kontroller.

Statistisk analyse Kolmogorov-Smirnov-testen vil blive brugt til at vurdere fordelingen af ​​demografiske, funktionelle og RT-PCR-variabler. Til sammenligning af grupper (IPF vs. NSIP) vil enten uparret t-test eller Mann-Whitney-testen, hvor angivet, blive brugt. Cox proportional hazard-analyse og modtagerdriftskarakteristika vil blive brugt til at bestemme styrken af ​​RT-PCR-variabler til at forudsige resultatet. Kappa-statistikker vil blive brugt til at vurdere diagnostisk overensstemmelse under MDD. Analyse af modtagerdriftskarakteristika vil blive brugt til at vurdere diagnostisk nøjagtighed (sensitivitet, specificitet, areal under kurven).

Definition af diagnose og post-biopsi klinisk forløb Den specifikke diagnose af IIP (IPF vs. NSIP) vil blive defineret baseret på multi-disciplinær diskussion (MDD) blandt behandlende kliniker, thorax radiolog og lungepatolog under hensyntagen til klinisk information thorax CT-scanning radiografisk mønster og patologisk mønster set på SLB. Diagnosen vil blive nået ved konsensus i henhold til gældende standard for praksis.

For at validere diagnosen vil patienterne blive fulgt i en periode på 3 år efter SLB. Rate af klinisk progression og overlevelse er signifikant forskellige i IPF vs. NSIP.

Klinisk progression fra diagnosetidspunktet (SLB) vil blive defineret som enten: >10 % absolut reduktion i forceret vitalkapacitet (FVC) % pred; >50 m fald i 6-minutters gåafstand (6MWD); indlæggelse på hospital af respiratoriske årsager; vurdering af lungetransplantation (LTx); eller død.

Klinikbesøg finder sted med 4-6 måneders intervaller, som dikteret af klinikeren. Ved hvert besøg vil MRC dyspnø-score, lungefunktionstests og 6-minutters gangtests data blive indsamlet.