Diagnosi molecolare delle polmoniti interstiziali idiopatiche: uno studio prospettico

Scopo dello studio Si tratta di uno studio prospettico osservazionale per raccogliere campioni di SLB, estrarre l'RNA, analizzare i profili trascrizionali mediante microarray e convalidare i profili di espressione genica precedentemente identificati e i livelli di espressione dei singoli geni rispetto alla diagnosi di IIP (IPF vs. NSIP), definito dalla discussione multidisciplinare e ulteriormente confermato dal successivo decorso clinico. Non è coinvolto alcun farmaco sperimentale.

Obiettivi specifici:

1. Testare e convalidare la riproducibilità dei profili di espressione genica di IPF e NSIP sul trascrittoma ottenuto da biopsie polmonari chirurgiche (omogenati polmonari), raccolti in modo prospettico.
2. Testare i profili di espressione genica di IPF e NSIP, rispettivamente, come predittori di sopravvivenza a 3 anni dal momento della biopsia. .
3. Testare i singoli livelli di espressione genica (marcatori di NSIP o IPF) negli omogenati polmonari da SLB con RT-PCR in tempo reale, come discriminatori di IPF rispetto a NSIP.

Sebbene la diagnosi di IPF o NSIP sarà stabilita da una discussione multidisciplinare, come da linee guida, al fine di convalidare ulteriormente le firme geniche e i singoli geni come discriminatori affidabili di IPF rispetto a NSIP, seguiremo in modo prospettico il decorso clinico dei pazienti per un periodo di 3 anni, per assicurarsi che il decorso clinico sia coerente con IPF (peggiore) o NSIP (migliore). I decorsi clinici medi di IPF e NSIP sono chiaramente stabiliti dalla nostra esperienza di 6 anni nel database delle malattie polmonari interstiziali.

Valutazione dei risultati attesi:

1. Definizione di una diagnosi di IPF vs. NSIP da parte di MDD tra Respirologo, Radiologo toracico e Patologo polmonare, secondo la pratica clinica corrente. La statistica Kappa sarà utilizzata anche per valutare l'impatto diagnostico delle tecniche diagnostiche molecolari.
2. Analisi completa dei microarray di tutti i SLB, inclusa l'analisi della significatività dei microarray, l'analisi dei componenti principali, il clustering gerarchico e l'analisi del percorso Ingenuity. La riproducibilità di profili di espressione genica predefiniti di IPF e NSIP sarà studiata su biopsie polmonari chirurgiche.
3. RT-PCR in tempo reale per misurare i livelli di espressione genica di 6 geni selezionati che possono differenziare IPF da NSIP.
4. Follow-up prospettico del decorso clinico (3 anni) per convalidare ulteriormente l'accuratezza diagnostica.
5. Studio del potere predittivo dei profili di espressione genica di IPF e NSIP (variabili categoriali) e del livello di espressione di 6 geni selezionati (variabili continue) verso la sopravvivenza a 3 anni dal momento della biopsia.
6. Valutazione dell'accuratezza diagnostica (area sotto la curva, sensibilità, specificità) delle tecniche molecolari, previa validazione della diagnosi con decorso clinico post-biopsia a 3 anni.

Soggetti Dopo aver escluso cause note (disturbi reumatoidi, esposizione professionale, ambientale o domestica, farmaci) di fibrosi polmonare, verranno reclutati nello studio i pazienti indirizzati a SLB per chiarire la diagnosi di IIP (IPF vs. NSIP). Sarà ottenuto il consenso informato e scritto.

Saranno registrate le caratteristiche demografiche e i test di funzionalità polmonare prima del SLB. La scansione TC del torace ad alta risoluzione pre-SLB sarà considerata insieme alla SLB durante MDD.

Conservazione e processazione dei campioni Al momento della SLB, un campione adeguato di ciascuna SLB sarà congelato con azoto liquido e conservato a -80ºC, fino a quando non verrà eseguita l'estrazione dell'RNA.

Estrazione dell'RNA e analisi del microarray L'RNA sarà isolato, marcato e ibridato con il gene umano 1.0 set array dal London Regional Genomic Centre secondo i protocolli del produttore (Illumina epicenter ScriptSeq).

I set di dati per esperimenti di microarray saranno resi disponibili presso il repository Gene Expression Omnibus.

Per l'analisi preliminare verrà utilizzato il software Partek (St.Louis, MO). I dati a livello di sonda verranno pre-elaborati. Ciò includerà una robusta correzione del background media multi-array e la normalizzazione dei dati, che verrà eseguita su tutti gli array utilizzando la normalizzazione quantile. I valori normalizzati e regolati in base allo sfondo verranno quindi compilati o riassunti utilizzando la tecnica della lucidatura mediana, per generare una singola misura di espressione. Come analisi esplorativa dei dati, verranno eseguite anche la mappatura dell'analisi delle componenti principali e l'analisi del rapporto F (rapporto segnale-rumore).

Per l'analisi significativa di microarray, verranno utilizzati 33.297 set di sonde. Il valore q sarà adottato come correzione di confronto multiplo e utilizzato per identificare i geni differenzialmente espressi. Il valore q rappresenta il rapporto minimo di false scoperte (FDR) al quale un singolo test di ipotesi può essere definito significativo.

Per il clustering gerarchico, verranno utilizzati Cluster 3.0 e Treeview (laboratorio di Eisen, Standford Univ.). Il clustering non supervisionato non tiene conto di nessuna delle variabili sperimentali come trattamento, fenotipo, tessuto, ecc. Durante il clustering.

L'analisi Ingenuity Pathway (IPA) è fondamentale per determinare l'espressione genica e le interazioni proteina-proteina nel contesto delle vie metaboliche o di segnalazione, e per capire come le proteine ​​operano e formano le vie, nel contesto dei profili di espressione selezionati. IPA è un potente database curato e un sistema di analisi per capire come le proteine ​​lavorano insieme per effettuare i cambiamenti cellulari.

Sono stati pubblicati i profili di espressione genica da prendere in considerazione per la convalida su SLB (Respiratory Research 2018 Aug 15;19:153). La firma genica di NSIP è composta da 86 geni, mentre la firma genica di IPF è composta da 60 geni. L'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore verrà utilizzata per determinare l'accuratezza dell'analisi dell'espressione genica nel determinare la diagnosi di IPF rispetto a NSIP (area sotto la curva, sensibilità, specificità).

RT-PCR La proteina ribosomiale large P0 sarà utilizzata come gene housekeeping. Sulla base dei nostri precedenti risultati sugli espianti polmonari, 6 geni saranno testati come discriminatori di IPF vs. NSIP su omogenati polmonari da SLB. Tutti i geni sono stati confrontati con i controlli normali.

Analisi statistica Il test di Kolmogorov-Smirnov sarà utilizzato per valutare la distribuzione delle variabili demografiche, funzionali e RT-PCR. Per il confronto dei gruppi (IPF vs. NSIP), verrà utilizzato il t-test non appaiato o il test di Mann-Whitney, dove indicato. L'analisi del rischio proporzionale di Cox e le caratteristiche operative del ricevitore saranno utilizzate per determinare la forza delle variabili RT-PCR nella previsione dell'esito. Le statistiche Kappa verranno utilizzate per valutare l'accordo diagnostico durante la MDD. L'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore sarà utilizzata per valutare l'accuratezza diagnostica (sensibilità, specificità, area sotto la curva).

Definizione della diagnosi e decorso clinico post-biopsia La diagnosi specifica di IIP (IPF vs. NSIP) sarà definita sulla base di una discussione multidisciplinare (MDD) tra il medico curante, il radiologo toracico e il patologo polmonare, prendendo in considerazione le informazioni cliniche della TC del torace pattern radiografico e pattern patologico visto sul SLB. La diagnosi sarà raggiunta per consenso, secondo l'attuale standard di pratica.

Per convalidare la diagnosi, i pazienti saranno seguiti per un periodo di 3 anni dopo il SLB. Il tasso di progressione clinica e la sopravvivenza sono significativamente differenti in IPF rispetto a NSIP.

La progressione clinica dal momento della diagnosi (SLB) sarà definita come: >10% di riduzione assoluta della capacità vitale forzata (FVC) % pred; >50 m di declino nella distanza percorsa a piedi in 6 minuti (6MWD); ricovero in ospedale per cause respiratorie; valutazione del trapianto di polmone (LTx); o la morte.

Le visite cliniche si svolgono a intervalli di 4-6 mesi, come dettato dal medico. Ad ogni visita, verranno raccolti i dati del punteggio di dispnea MRC, dei test di funzionalità polmonare e dei test del cammino di 6 minuti.