특발성 간질성 폐렴의 분자진단: 전향적 연구

연구의 목적 이것은 SLB 샘플을 수집하고, RNA를 추출하고, 마이크로어레이로 전사 프로필을 분석하고, 이전에 확인된 유전자 발현 프로필과 IIP(IPF vs. NSIP) 진단에 대한 개별 유전자 발현 수준을 확인하기 위한 전향적 관찰 시험입니다. 여러 분야의 토론에 의해 정의되고 후속 임상 과정에 의해 추가로 확인됩니다. 관련된 실험 약물이 없습니다.

구체적인 목표:

1. 전향적으로 수집된 외과적 폐 생검(폐 균질물)에서 얻은 전사체에서 IPF 및 NSIP의 유전자 발현 프로필의 재현성을 테스트하고 검증합니다.
2. 생검 시점으로부터 3년 생존의 예측인자로 각각 IPF 및 NSIP의 유전자 발현 프로필을 테스트합니다. .
3. 실시간 RT-PCR을 사용하여 SLB의 폐 균질화에서 개별 유전자 발현 수준(NSIP 또는 IPF의 마커)을 IPF 대 NSIP의 판별자로 테스트합니다.

IPF 또는 NSIP의 진단은 가이드라인에 따라 다학제적 논의에 의해 확립될 것이지만 IPF 대 NSIP의 신뢰할 수 있는 판별자로서 유전자 서명 및 단일 유전자를 추가로 검증하기 위해 우리는 전향적으로 환자의 임상 경과를 따라갈 것입니다. 임상 과정이 IPF(더 나쁨) 또는 NSIP(더 나음)와 일치하는지 확인하기 위해 3년의 기간. IPF 및 NSIP의 평균 임상 과정은 6년 간의 간질성 폐 질환 데이터베이스 경험에 의해 명확하게 설정됩니다.

예상 결과 평가:

1. 현재 임상 실습에 따라 호흡기 전문의, 흉부 방사선 전문의 및 폐 병리 전문의 사이에서 MDD에 의한 IPF 대 NSIP의 진단 정의. Kappa 통계는 또한 분자 진단 기술의 진단 영향을 평가하는 데 사용될 것입니다.
2. 마이크로어레이의 유의성 분석, 주성분 분석, 계층적 클러스터링 및 독창성 경로 분석을 포함한 모든 SLB의 포괄적인 마이크로어레이 분석. IPF 및 NSIP의 사전 정의된 유전자 발현 프로파일의 재현성은 외과적 폐 생검에서 연구될 것입니다.
3. IPF와 NSIP를 구별할 수 있는 6개의 선택된 유전자의 유전자 발현 수준을 측정하기 위한 실시간 RT-PCR.
4. 진단 정확도를 추가로 검증하기 위한 임상 과정(3년)의 전향적 후속 조치.
5. 생검 시점으로부터 3년 생존에 대한 IPF 및 NSIP의 유전자 발현 프로파일(범주 변수) 및 6개의 선택된 유전자의 발현 수준(연속 변수)의 예측력 연구.
6. 생검 후 3년 임상 과정으로 진단을 검증한 후 분자 기술의 곡선 아래 진단 정확도 영역, 민감도, 특이도) 평가.

피험자 폐 섬유증의 알려진 원인(류마티스 장애, 직업적, 환경적 또는 가정적 노출, 약물)을 배제한 후, IIP(IPF 대 NSIP)의 진단을 명확히 하기 위해 SLB를 의뢰하는 환자를 연구에 모집할 것입니다. 사전 서면 동의를 얻습니다.

SLB 이전의 인구학적 특성 및 폐 기능 테스트가 기록됩니다. 사전 SLB 고해상도 흉부 CT 스캔은 MDD 동안 SLB와 함께 고려됩니다.

샘플 보관 및 처리 SLB 시 각 SLB의 적절한 샘플을 액체 질소로 급속 동결하고 RNA 추출이 수행될 때까지 -80ºC에서 보관합니다.

RNA 추출 및 마이크로어레이 분석 RNA는 제조업체의 프로토콜(Illumina 진원지 ScriptSeq)에 따라 London Regional Genomic Center에서 인간 유전자 1.0 세트 어레이에 분리, 표지 및 혼성화됩니다.

마이크로어레이 실험을 위한 데이터 세트는 Gene Expression Omnibus 저장소에서 사용할 수 있습니다.

Partek 소프트웨어(St.Louis, MO)가 예비 분석에 사용됩니다. 프로브 수준 데이터는 사전 처리됩니다. 여기에는 분위수 정규화를 사용하여 모든 어레이에서 수행되는 강력한 다중 어레이 평균 배경 보정 및 데이터 정규화가 포함됩니다. 배경 조정 및 정규화된 값은 중앙값 다듬기 기술을 사용하여 컴파일 또는 요약되어 단일 표현 측정값을 생성합니다. 탐색적 데이터 분석으로 주성분 분석 매핑 및 F 비율 분석(신호 대 잡음비)도 수행됩니다.

Microarray의 유의미한 분석을 위해 33,297개의 프로브 세트가 사용됩니다. q 값은 다중 비교 보정으로 채택되어 차별적으로 발현된 유전자를 식별하는 데 사용됩니다. q 값은 개별 가설 테스트가 중요하다고 할 수 있는 최소 거짓 발견 비율(FDR)을 나타냅니다.

계층적 군집화는 Cluster 3.0과 Treeview(Eisen 연구실, Standford Univ.)를 사용한다. 감독되지 않은 클러스터링은 클러스터링하는 동안 치료, 표현형, 조직 등과 같은 실험 변수를 고려하지 않습니다.

독창성 경로 분석(IPA)은 대사 또는 신호 경로의 맥락에서 유전자 발현 및 단백질-단백질 상호작용을 결정하고, 선택된 발현 프로파일의 맥락에서 단백질이 어떻게 작동하고 경로를 형성하는지 이해하는 기본적인 역할입니다. IPA는 단백질이 어떻게 함께 작용하여 세포 변화에 영향을 미치는지 이해하기 위한 강력한 선별 데이터베이스 및 분석 시스템입니다.

SLB에 대한 검증을 위해 고려되는 유전자 발현 프로필이 발표되었습니다(Respiratory Research 2018 Aug 15;19:153). NSIP의 유전자 서명은 86개의 유전자로 구성되는 반면 IPF의 유전자 서명은 60개의 유전자로 구성됩니다. IPF 대 NSIP(곡선 아래 영역, 민감도, 특이도)의 진단을 결정할 때 유전자 발현 분석의 정확도를 결정하기 위해 수신기 작동 특성 분석이 사용될 것입니다.

RT-PCR Ribosomal protein large P0은 하우스키핑 유전자로 사용될 것입니다. 폐 외식편에 대한 우리의 이전 결과에 기초하여, 6개의 유전자가 SLB로부터의 폐 균질물에 대한 IPF 대 NSIP의 판별자로서 시험될 것이다. 모든 유전자는 정상 대조군에 대해 교차 확인되었습니다.

통계 분석 Kolmogorov-Smirnov 테스트는 인구통계, 기능 및 RT-PCR 변수의 분포를 평가하는 데 사용됩니다. 그룹 비교(IPF 대 NSIP)를 위해, unpaired t-test 또는 표시된 경우 Mann-Whitney 테스트가 사용됩니다. Cox 비례 위험 분석 및 수신기 작동 특성을 사용하여 예측 결과에서 RT-PCR 변수의 강도를 결정합니다. Kappa 통계는 MDD 동안 진단 일치를 평가하는 데 사용됩니다. 수신기 작동 특성 분석은 진단 정확도(민감도, 특이도, 곡선 아래 영역)를 평가하는 데 사용됩니다.

진단 및 생검 후 임상 과정의 정의 IIP(IPF 대 NSIP)의 특정 진단은 임상 정보 흉부 CT 스캔을 고려하여 치료 임상의, 흉부 방사선 전문의 및 폐 병리학자 간의 다학제적 토론(MDD)을 기반으로 정의됩니다. SLB에서 보이는 방사선 패턴 및 병리 패턴. 진단은 현재 실무 표준에 따라 합의에 의해 이루어집니다.

진단을 확인하기 위해 SLB 후 3년 동안 환자를 추적합니다. 임상 진행률과 생존율은 IPF와 NSIP에서 크게 다릅니다.

진단 시점(SLB)으로부터의 임상적 진행은 다음 중 하나로 정의될 것입니다: >10% 강제 폐활량(FVC) % 예측의 절대 감소; 6분 도보 거리(6MWD)에서 >50m 하강; 호흡기 원인으로 병원 입원; 폐 이식(LTx) 평가; 또는 죽음.

클리닉 방문은 임상의가 지시한 대로 4-6개월 간격으로 이루어집니다. 방문할 때마다 MRC 호흡곤란 점수, 폐 기능 검사 및 6분 보행 검사 데이터를 수집합니다.