Zaangażowanie mikroflory jelitowej w mózg w utracie kontroli nad jedzeniem (GMBTalk-Food)

Badanie obejmuje projekt przekrojowy (porównanie osób z otyłością i bez otyłości) w celu oceny parametrów związanych z uzależnieniem od jedzenia za pomocą zatwierdzonych kwestionariuszy. Scharakteryzowany zostanie profil metaboliczny i behawioralny łączności kohorty i przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) za pomocą fMRI. Skład i funkcjonalność metagenomu jelitowego tych osób zostanie przeanalizowana pod kątem jego powiązań z parametrami metabolicznymi i behawioralnymi oraz danymi obrazowymi. Ponieważ miRNA mogą działać jako epigenomiczne mediatory efektów metagenomu wpływających na mózg, przeanalizowany zostanie również szeroki profil miRNA krążących w osoczu.

Tematy i metody:

Zrekrutowana zostanie kohorta osób (n = 100, 50% z otyłością), u których zostaną zebrane parametry uzależnienia od żywności (wrażliwość na nagrodę, wrażliwość na karę i skala Yale Food Addiction Scale (wynik YFAS 2.0). Projekt będzie realizowany u osób z otyłością (25 mężczyzn, 25 kobiet, wskaźnik masy ciała (BMI) > = 30kg/m2) oraz osób bez otyłości, podobnych pod względem wieku i płci (25 mężczyzn, 25 kobiet, BMI

A. Badanie przekrojowe:

Pacjenci z otyłością wcześniej zapisani do Oddziału Endokrynologii, Cukrzycy i Żywienia (UDEN) Szpitala „Dr. Josep Trueta” z Girony (Hiszpania) zostanie zatrudniony i przestudiowany. Osoby bez otyłości będą również rekrutowane poprzez ogłoszenie publiczne.

Na dziesięć dni zostanie wszczepiony czujnik glikemii, a także urządzenie do śledzenia aktywności i snu, które rejestrować będzie aktywność fizyczną w tym okresie. Śródmiąższowe podskórne stężenie glukozy będzie monitorowane ambulatoryjnie przez okres 10 kolejnych dni przy użyciu czujnika glukozy zatwierdzonego przez FDA (Dexcom G6®). Czujnik zostanie wszczepiony w dniu 0 i zostanie wycofany w dniu 10 w południe. Zapisy poziomu glukozy będą najlepiej oceniane w dniach od 2 do 9, aby uniknąć odchylenia spowodowanego wkładaniem i wyjmowaniem czujnika, co uniemożliwia wystarczającą stabilizację systemu monitorowania. Charakterystyczny wzorzec glikemii każdego pacjenta zostanie obliczony jako średnia z profili uzyskanych w dniach od 2 do 9.

Po 10 dniach zostanie pobrany mocz i kał w celu zbadania mikroflory jelitowej. Badani zostaną poddani badaniu krwi na czczo, a po jedzeniu zostaną przeprowadzone testy neuropsychologiczne. Następnie czujnik i urządzenie do monitorowania aktywności fizycznej/snu zostaną usunięte. Na koniec zostanie wykonane fMRI w celu oceny zawartości żelaza w mózgu (R2*) oraz parametrów „obrazowania tensora dyfuzji” w różnych obszarach mózgu. Scharakteryzujemy łączność mPFC u osób w tej kohorcie za pomocą funkcjonalnego MRI stanu spoczynku i łączności strukturalnej za pomocą MRI.

Zbadany zostanie skład metagenomiczny jelit i funkcjonalność związana z tymi cechami poznawczymi, miRNA i metabolitami w danych obrazowania osocza i mózgu.

Planowanie wizyty:

Wizyta 1 (dzień 1): Badanie fizykalne, ankieta żywieniowa, bioimpedancja, densytometria, czujnik glikemii oraz urządzenie do śledzenia aktywności i snu. Formularz zgody.

Wizyta 2 (dzień 10): Próbka: krew, mocz i kał. Kwestionariusz diety, Ocena neuropsychologiczna, Wycofanie czujnika glikemii. Wycofanie urządzenia do śledzenia aktywności i snu, fMRI.

ZBIERANIE DANYCH O PODMIOTACH BADANIA PRZEKROJOWEGO:

1. Dane pomocnicze: Wiek, płeć i data urodzenia.

2. Zmienne kliniczne:

   • Waga
   • wzrost,
   • wskaźnik masy ciała
   • obwód talii i bioder
   • stosunek obwodu talii do bioder
   • ciśnienie krwi (skurczowe i rozkurczowe)
   • masa tłuszczu i wolna masa tłuszczu (impedancja bioelektryczna i DEXA)
   • stan palenia
   • spożycie alkoholu
   • rejestr zwykłych leków
   • osobista historia transfuzji krwi i/lub dawstwa
   • zapis historii rodzinnej otyłości, incydentów sercowo-naczyniowych i cukrzycy
   • historia zaburzeń psychicznych i zaburzeń odżywiania.

3. Zmienne laboratoryjne: od osób na czczo zostanie pobrane 15 cm3 krwi w celu określenia następujących zmiennych przy użyciu zwykłych rutynowych technik stosowanych w laboratorium klinicznym:

   • hemogram
   • glukoza
   • bilirubina
   • aminotransferaza asparaginianowa (AST/GOT)
   • aminotransferaza alaninowa (ALT/GPT)
   • transpeptydaza gamma-glutamylowa (GGT)
   • mocznik
   • kreatynina
   • kwas moczowy
   • białka ogółem,
   • albumina
   • cholesterol całkowity | cholesterol HDL | cholesterolu LDL
   • trójglicerydy,
   • hemoglobina glikowana (HbA1c)
   • ferrytyna | rozpuszczalny receptor transferyny
   • ultraczułe białko C-reaktywne
   • szybkość sedymentacji erytrocytów
   • białko wiążące lipopolisacharydy
   • wolna tyroksyna (wolna T4) | hormon tyreotropowy (TSH) | wyjściowy kortyzol -insulina w osoczu
   • markery stanu zapalnego | interleukina 6 (IL-6). Dodatkowe 20 cm3 krwi (osocze-EDTA), 18 cm3 surowicy i 20 cm3 osocza z heparyną zostanie pobrane do dalszej analizy.

4. Pobieranie próbek kału: Próbka kału zostanie pobrana od każdego pacjenta. Próbkę należy pobrać w domu lub w szpitalu, przesłać do laboratorium w ciągu 4 godzin od pobrania, rozdrobnić i przechowywać w temperaturze -80ºC.

   Analiza mikroflory jelitowej w kale:

   * Ekstrakcja genomowego DNA kału i sekwencjonowanie całego genomu. Całkowite DNA zostanie wyekstrahowane z zamrożonego ludzkiego kału przy użyciu mini zestawu kału QIAamp DNA (Qiagen, Courtaboeuf, Francja). Oznaczenie ilościowe DNA zostanie przeprowadzone za pomocą fluorometru Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA). Następnie 1 ng z każdej próbki (0,2 ng/μl) zostanie użyte do przygotowania bibliotek shotgun do wysokowydajnego sekwencjonowania, przy użyciu zestawu Nextera DNA Flex Library Prep (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) zgodnie do protokołu producenta. Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone na systemie sekwencjonowania NextSeq 500 (Illumina) z chemią sparowanych końców 2 X 150 bp, w obiektach Służby Sekwencjonowania i Bioinformatyki FISABIO (Walencja, Hiszpania).

5. Pobranie próbki moczu: Niezbędne do określenia zmian w szlakach metabolicznych związanych z metabolizmem tryptofanu oraz do określenia roli mikroflory jelitowej w tych przemianach metabolicznych.
6. Metabolomika w osoczu i kale: Oprócz analiz metabolomicznych w próbkach moczu, analizy metabolomiczne zostaną przeprowadzone przy użyciu technik takich jak 1H-NMR i HPLC-MS/MS w próbkach osocza i kału.
7. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego: Wszystkie badania MRI będą wykonywane na skanerze 1,5-T (Ingenia ®; Philips Medical Systems). Po pierwsze, sekwencja rekonwalescencji osłabionej płynem (FLAIR) zostanie zastosowana w celu wykluczenia osobników z istniejącymi wcześniej uszkodzeniami mózgu. Obciążenie żelazem mózgu zostanie ocenione za pomocą wartości R2*. Dane relaksacyjne T2* zostaną pozyskane za pomocą wieloechowej sekwencji echa gradientowego z 10 równomiernie rozmieszczonymi echami (pierwsze echo=4,6 ms; odstęp między echami = 4,6 ms; czas powtórzenia = 1300ms). T2* zostanie obliczone przez dopasowanie pojedynczych składników wykładniczych do krzywych zaniku sygnału odpowiednich danych wieloechowych. Wartości R2* zostaną obliczone jako R2*=1/T2* i wyrażone jako Hz. Ponadto wartości R2* zostaną przeliczone na jednostki µmol Fe/g, zgodnie z wcześniejszą walidacją w testach fantomowych. Obrazy żelaza mózgowego od osób kontrolnych zostaną znormalizowane do standardowej przestrzeni przy użyciu w tym celu obrazu szablonu (szablon EPI MNI). Następnie wszystkie znormalizowane obrazy zostaną uśrednione w celu określenia normalnej zawartości żelaza. Normalne wartości (średnia i odchylenie standardowe) zostaną również obliczone dla interesujących obszarów anatomicznych przy użyciu różnych masek atlasu, uwzględniając możliwe różnice między płcią a wiekiem. Porównanie żelaza w mózgu między osobami z grupy kontrolnej i otyłymi zostanie przeprowadzone przy użyciu analizy opartej na wokselach. Obrazy osób otyłych zostaną znormalizowane do standardowej przestrzeni. Znormalizowany obraz zostanie porównany z normalną populacją przy użyciu analizy testu t z wiekiem i płcią jako zmiennymi towarzyszącymi. W rezultacie mapa parametryczna pokaże indywidualne różnice w depozycji żelaza. W oparciu o wcześniejsze badania obserwacyjne wykazujące zwiększone obciążenie żelazem mózgu w niektórych określonych regionach oraz dowody sugerujące zmiany w hipokampie i podwzgórzu w związku z otyłością i insulinoopornością, analizy statystyczne i obrazowe skupią się na różnicach w żelazie w jądrze ogoniastym, soczewkowatym, wzgórzu i podwzgórzu , hipokamp i ciało migdałowate.
8. Badanie neuropsychologiczne: Zbadane zostaną różne dziedziny poznania: pamięć (Test aprendizaje werbalny-TAVEC, Rey-Osterrieth Complex Figure) uwaga i funkcje wykonawcze (WAIS-IV, test tworzenia szlaków (część A i B), test Stroopa), poznanie (POFA i BFRT), język (zwierzęta). Ponadto depresja (PHQ9), lęk (Inwentarz Stanu-Cechy Lęku (STAI)), impulsywność (Skala Impulsywnego Zachowania (UPPS-P)), wrażliwość na karę i nagrodę (Wrażliwość na karę i wrażliwość na nagrodę (SRSPQ)), jedzenie uzależnienie (Yale Food Addiction Scale (YFAS II)), zaburzenie z napadami objadania się (skala Binge Eating), subiektywne samopoczucie, afekt pozytywny i negatywny (Harmonogram pozytywnych i negatywnych afektów (PANAS)), rozpoznawanie emocji (Pictures of Facial Affect i Benton Facial Test rozpoznawania) zostaną zbadane za pomocą testów psychologicznych.

9. Profil krążących miRNA: Dodatkowo, oprócz analiz metabolomicznych próbek moczu, zostaną przeprowadzone analizy metabolomiczne przy użyciu technik takich jak 1H-NMR i HPLC-MS/MS w próbkach osocza i kału.

   • Ekstrakcja i oczyszczanie krążącego RNA: Osocze zostanie otrzymane przez standardowe nakłucie żyły i odwirowanie przy użyciu probówek Vacutainer pokrytych EDTA (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Separacja osocza zostanie przeprowadzona przez podwójne wirowanie z użyciem wirówki laboratoryjnej (Beckman J-6M Induction Drive Centrifuge, Beckman Instruments Inc). Ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona z początkowej objętości 300 μl osocza przy użyciu zestawu do izolacji mirVana PARIS (Applied Biosystems, Darmstadt, Niemcy).
   • Retrotranskrypcja krążących miRNA i wstępna amplifikacja: Ustalona objętość 3 μl roztworu RNA z 40 ml eluatu izolatu RNA zostanie użyta jako wejście do retrotranskrypcji przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji miRNA TaqMan (Life Technology, Darmstadt, Niemcy). Wstępna amplifikacja zostanie przeprowadzona przy użyciu TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technology, Darmstadt, Niemcy).
   • Analiza poszczególnych miRNA za pomocą sond do hydrolizy TaqMan: Ekspresja genów zostanie oceniona za pomocą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Barcelona, ​​Hiszpania), przy użyciu odpowiedniej technologii TaqMan do ilościowego określenia względnej ekspresji genów.
10. Drosophila

Odpowiednia mikroflora jelitowa zidentyfikowana w kohorcie ludzkiej zostanie najpierw przetestowana na Drosophila. Przeprowadzone zostaną wysokowydajne badania przesiewowe Drosophila pod kątem metabolicznych i behawioralnych skutków mikroflory jelitowej zidentyfikowanej u myszy z utratą kontroli nad karmieniem. Szczepy mikroorganizmów pozyskane z magazynów będą hodowane z dużą wydajnością w warunkach odpowiednich do selekcji bakterii tolerujących powietrze w celu asocjacji z muchami. Bakterie te zostaną wykorzystane do wytworzenia monoasocjalnych much gnotobiotycznych, które zostaną przeanalizowane pod kątem zmian w zachowaniu żywieniowym przy użyciu wysokowydajnego ilościowego testu żywieniowego flyPAD. Przetestujemy zarówno muchy w pełni odżywione, jak i muszki pozbawione aminokwasów. Szczepy bakteryjne zidentyfikowane jako modyfikatory chęci jedzenia zostaną ocenione pod kątem ich wpływu na metabolizm much przy użyciu standardowych metod metabolomicznych. W ramach tego zadania zostaną zidentyfikowane konkretne szczepy bakterii zdolne do modyfikowania popędu żywieniowego oraz reakcji behawioralnych i metabolicznych Drosophila.

Informacje pozostaną zarejestrowane w notatniku i zostaną skomputeryzowane w bazie danych badania.

METODY STATYCZNE:

Wielkość próby: Nie ma wcześniejszych danych wykazujących oczekiwane różnice w szacowaniu wielkości próby w odniesieniu do zmienności glukozy, aktywności fizycznej, składu mikroflory jelitowej i funkcji poznawczych. W poprzednim badaniu różnice w zawartości żelaza w mózgu zaobserwowano u 20 osób otyłych i 20 osób nieotyłych. Zatem proponowana wielkość próby to co najmniej 20 osób na grupę, przy zrównoważonej reprezentacji wieku i płci (kobiety przed i po menopauzie).

Test t-Studenta dla prób niezależnych zostanie wykorzystany do porównania zmiennych osób z otyłością i osób bez otyłości. Przed analizą statystyczną dane zostaną znormalizowane przy użyciu określonych procedur normalizacyjnych. Następnie zbadany zostanie rozkład normalny i jednorodność wariancji. Parametry niespełniające tych wymagań zostaną przekształcone logarytmicznie (log10). Test t-Studenta dla sparowanych próbek zostanie wykorzystany do zbadania różnic przed i po obserwacji. Znaczące powiązania, zarówno pozytywne, jak i negatywne, będą dalej badane (prosta analiza regresji liniowej i wielowymiarowej).

Analiza metagenomiczna.

Surowe liczby zostaną przekształcone przy użyciu wyśrodkowanej transformacji logarytmicznej (clr) zaimplementowanej w pakiecie R „ALDEx2”. Gatunki bakterii i funkcje związane z żelazem mózgowym i krążącymi mikroRNA zostaną zidentyfikowane przy użyciu solidnych modeli regresji liniowej, takich jak te zaimplementowane w pakiecie R. Limma R, z uwzględnieniem wieku, wskaźnika masy ciała, płci i lat nauki. Funkcje taksonów i bakterii zostaną wcześniej przefiltrowane, tak aby wybrane zostały tylko te, które mają więcej niż 10 odczytów w co najmniej pięciu próbkach. Wartości p zostaną dostosowane do wielokrotnych porównań przy użyciu sekwencyjnej dobroci dopasowania, jak zaimplementowano w pakiecie R „SGoF”. Wykazano, że SGoF działa szczególnie lepiej niż metody FDR przy dużej liczbie testów i małej wielkości próby, co ma miejsce w przypadku dużych zestawów danych omicznych. Istotność statystyczna zostanie ustalona na poziomie p skorygowanym

Ciągłe monitorowanie glukozy

Ryzyka glikemii i miary zmienności, które należy ocenić, to odchylenie standardowe (SD), współczynnik zmienności (CV), średnia amplituda skoków glikemii (MAGE), wskaźnik ryzyka (RI), niski wskaźnik glukozy we krwi (LBGI) i wysoki poziom glukozy we krwi indeks glukozowy (HBGI). Dodatkowo procent (%) czasu w zakresie (70-180mg/dL), % czasu w euglikemii (70-140 mg/dL), hipoglikemii (180 mg/dL). Miary zmienności glikemii obliczono za pomocą oprogramowania Matlab (R2018a).