Involvering av tarmmikrobiota-hjärnan övertal i förlusten av ätkontroll (GMBTalk-Food)

Studien inkluderar en tvärsnittsdesign (jämförelse av försökspersoner med och utan fetma) för att bedöma parametrar associerade med matberoende genom validerade frågeformulär. Den metaboliska och beteendemässiga profilen för kohorten och den mediala prefrontala cortex (mPFC) anslutningen med hjälp av fMRI kommer att karakteriseras. Sammansättningen och funktionaliteten av tarmmetagenomet hos dessa ämnen kommer att analyseras i termer av dess kopplingar till metaboliska och beteendemässiga parametrar och bilddata. Eftersom miRNA kan fungera som epigenomiska mediatorer av metagenomeffekter som påverkar hjärnan, kommer en bred profil av miRNA som cirkulerar i plasma också att analyseras.

Ämnen och metoder:

En kohort av försökspersoner (n=100, 50% med fetma) kommer att rekryteras i vilka parametrar för matberoende (belöningskänslighet, straffkänslighet och Yale Food Addiction Scale (YFAS 2.0-poäng) kommer att samlas in. Projektet kommer att genomföras i ämnen med fetma (25 män, 25 kvinnor, Body mass index (BMI) > = 30 kg/m2) och ämnen utan fetma, liknande ålder och kön (25 män, 25 kvinnor, BMI

A. Tvärsnittsstudie:

Patienter med fetma som tidigare schemalagts till Service of Endocrinology, Diabetes and Nutrition (UDEN) på sjukhuset "Dr. Josep Trueta" från Girona (Spanien) kommer att rekryteras och studeras. Försökspersoner utan fetma kommer också att rekryteras genom ett offentligt tillkännagivande.

En glykemisensor kommer att implanteras i tio dagar, samt en aktivitets- och sömnspårare för att registrera fysisk aktivitet under denna tidsperiod. Interstitiell subkutan glukoskoncentration kommer att övervakas polikliniskt under en tidsperiod av 10 dagar i följd med hjälp av en glukossensor validerad av FDA (Dexcom G6 ®). Sensorn kommer att implanteras på dag 0 och går ut på dag 10 mitt på förmiddagen. Glukosregistreringar kommer företrädesvis att utvärderas på dagarna 2 till 9 för att undvika den fördom som orsakas av insättning och borttagning av sensorn, vilket förhindrar en tillräcklig stabilisering av övervakningssystemet. Det karakteristiska glykemiska mönstret för varje patient kommer att beräknas i genomsnitt från profilerna som erhålls dag 2 till 9.

Efter 10 dagar kommer urin och avföring att samlas in för att studera tarmmikrobiotan. Försökspersoner kommer att genomgå ett fastande blodprov och efter att ha ätit kommer neuropsykologiska tester att utföras. Därefter tas sensorn och enheten för övervakning av fysisk aktivitet/sömn bort. Slutligen kommer fMRI att göras för att utvärdera järnhalten i hjärnan (R2*) och parametrarna för "Diffusion Tensor Imaging" i olika hjärnterritorier. Vi kommer att karakterisera mPFC-anslutning hos försökspersoner i denna kohort genom funktionell MRI i vilotillstånd och strukturell anslutning med MRI.

Den metagenomiska sammansättningen och funktionaliteten i tarmen associerad med dessa kognitiva egenskaper, miRNA och metaboliter i plasma- och hjärnavbildningsdata kommer att studeras.

Besöksplanering:

Besök 1 (dag 1): Fysisk undersökning, näringsundersökning, bioimpedans, densitometri, glykemisensor och aktivitets- och sömnspårningsenhet. Samtyckesformulär.

Besök 2 (dag 10): Prov: blod, urin och avföring. Kostenkät, Neuropsykologisk bedömning, Glykemisensorabstinens. Aktivitets- och sömnspårningsenhet, fMRI.

DATAINSAMLING AV ÄMNEN I Tvärsektionsstudier:

1. Subsidiärdata: Ålder, kön och födelsedatum.

2. Kliniska variabler:

   • Vikt
   • höjd,
   • Body mass Index
   • midja och höft omkrets
   • midja-till-höft-förhållande
   • blodtryck (systoliskt och diastoliskt)
   • fettmassa och fettfri massa (bioelektrisk impedans och DEXA)
   • rökstatus
   • alkoholintag
   • register över vanliga läkemedel
   • personlig historia av blodtransfusion och/eller donation
   • ett register över familjehistoria av fetma, kardiovaskulära händelser och diabetes
   • psykiatrisk och ätstörningshistoria.

3. Laboratorievariabler: 15 cc blod kommer att extraheras från fastande försökspersoner för att fastställa följande variabler med de vanliga rutinteknikerna i det kliniska laboratoriet:

   • hemogram
   • glukos
   • bilirubin
   • aspartataminotransferas (AST/GOT)
   • alaninaminotransferas (ALT/GPT)
   • gamma-glutamyl transpeptidas (GGT)
   • urea
   • kreatinin
   • urinsyra
   • totala proteiner,
   • albumin
   • totalt kolesterol | HDL-kolesterol | LDL-kolesterol
   • triglycerider,
   • glykerat hemoglobin (HbA1c)
   • ferritin | löslig transferrinreceptor
   • ultrakänsligt C-reaktivt protein
   • erytrocytsedimentationshastighet
   • lipopolysackaridbindande protein
   • fritt tyroxin (fritt T4) | sköldkörtelstimulerande hormon (TSH) | baslinjekortisol-plasmainsulin
   • inflammationsmarkörer | interleukin 6 (IL-6). Ytterligare 20 cc blod (plasma-EDTA), 18 cc serum och 20 cc plasma med heparin kommer att extraheras för vidare analys.

4. Samling av avföringsprov: Ett avföringsprov kommer att tillhandahållas från varje patient. Provet ska samlas in hemma eller på sjukhuset, skickas till laboratoriet inom 4 timmar från insamlingen, fragmenteras och förvaras vid -80ºC.

   Analys av tarmmikrobiota i avföring:

   *Fekal genomisk DNA-extraktion och helgenomsekvensering. Totalt DNA kommer att extraheras från fryst mänsklig avföring med hjälp av QIAamp DNA mini pallkit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike). DNA-kvantifiering kommer att utföras med en Qubit 3.0 fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA). Därefter kommer 1 ng av varje prov (0,2 ng/μl) att användas för beredning av hagelgevärsbibliotek för sekvensering med hög genomströmning, med hjälp av Nextera DNA Flex Library Prep kit (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) enligt till tillverkarens protokoll. Sekvensering kommer att utföras på ett NextSeq 500 sekvenseringssystem (Illumina) med 2 X 150-bp parad kemi, vid anläggningarna för Sequencing and Bioinformatics Service av FISABIO (Valencia, Spanien).

5. Urinprovtagning: Nödvändig för att bestämma förändringar i de metaboliska vägarna som är involverade i tryptofanmetabolism och för att bestämma tarmmikrobiotans roll i dessa metabola förändringar.
6. Metabolomik i plasma och avföring: Utöver metabolomiska analyser i urinprover kommer metabolomiska analyser att utföras med tekniker som 1H-NMR och HPLC-MS/MS i plasma- och avföringsprover.
7. Magnetisk resonanstomografi: Alla MRT-undersökningar kommer att utföras på en 1,5-T-skanner (Ingenia ®; Philips Medical Systems). Först kommer en vätskeförsvagad inversionsåtervinning (FLAIR)-sekvens att användas för att utesluta försökspersoner med redan existerande hjärnskador. Hjärnans järnbelastning kommer att bedömas med hjälp av R2*-värden. T2*-relaxationsdata kommer att erhållas med en multi-eko gradient-ekosekvens med 10 ekon med lika mellanrum (första ekot=4,6ms; mellanekoavstånd=4,6ms; upprepningstid=1300ms). T2* kommer att beräknas genom att anpassa de enskilda exponentialtermerna till signalavklingningskurvorna för respektive multi-ekodata. R2*-värden kommer att beräknas som R2*=1/T2* och uttrycks som Hz. Dessutom kommer R2*-värden att omvandlas till μmol Fe/g-enheter som tidigare validerats på fantomtester. Hjärnjärnbilder från kontrollobjekt kommer att normaliseras till ett standardutrymme med hjälp av en mallbild för detta ändamål (EPI MNI-mall). Därefter kommer alla normaliserade bilder att beräknas i medeltal för bestämning av normal järnhalt. Normala värden (medelvärde och SD) kommer också att beräknas för anatomiska regioner av intresse med hjälp av olika atlasmasker, med hänsyn till eventuella skillnader mellan kön och ålder. Järnjämförelsen mellan kontroll- och överviktiga försökspersoner kommer att utföras med hjälp av voxel-baserad analys. Överviktiga bilder kommer att normaliseras till ett standardutrymme. Den normaliserade bilden kommer att jämföras med normalpopulationen med hjälp av t-testanalys med ålder och kön som kovariabler. Som ett resultat kommer en parametrisk karta att visa individuella skillnader i järndepositionen. Baserat på tidigare observationsstudier som visar ökad järnbelastning i hjärnan i vissa specifika regioner och bevis som tyder på förändringar i hippocampus och hypotalamus i samband med fetma och insulinresistens, kommer de statistiska analyserna och bildanalyserna att fokuseras på järnskillnader vid kaudat, lins, talamus, hypotalamus , hippocampus och amygdala.
8. Neuropsykologisk undersökning: Olika kognitionsdomäner kommer att utforskas: minne (Test aprendizaje verbal-TAVEC, Rey-Osterrieth Complex Figure) uppmärksamhet och exekutiv funktion (WAIS-IV, Trail making-test (Del A och B), Stroop-test), social kognition (POFA och BFRT), språk (djur). Dessutom depression (PHQ9), ångest (State-Trait Anxiety Inventory (STAI)), impulsivitet (Impulsive Behaviour Scale (UPPS-P)), känslighet för straff och belöning (Sensitivity to Punishment and Sensitivity to Reward (SRSPQ)), mat beroende (Yale Food Addiction Scale (YFAS II)), hetsätningsstörning (Binge Eating-skalan), subjektivt välbefinnande, positiv och negativ påverkan (Positive and Negative Affect Schedule (PANAS)), känslomässig igenkänning (Bilder av Facial Affect och Benton Facial Recognition Test) kommer att utforskas genom psykologiska tester.

9. Profil för cirkulerande miRNA: Utöver metabolomiska analyser i urinprover kommer metabolomiska analyser att utföras med hjälp av tekniker som 1H-NMR och HPLC-MS/MS i plasma- och avföringsprover.

   • Cirkulerande RNA-extraktion och rening: Plasma kommer att erhållas genom standard venpunktion och centrifugering med EDTA-belagda Vacutainer-rör (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Plasmaseparation kommer att utföras genom dubbelcentrifugering med en laboratoriecentrifug (Beckman J-6M Induction Drive Centrifuge, Beckman Instruments Inc). RNA-extraktion kommer att utföras från en initial volym på 300 μL plasma med hjälp av mirVana PARIS isoleringskit (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland).
   • Retrotranskription av cirkulerande miRNA och preamplifiering: En fast volym på 3 μL RNA-lösning från 40 ml eluatet av RNA-isolatet kommer att användas som input för retrotranskription med TaqMan miRNA omvänd transkriptionskit (Life Technology, Darmstadt, Tyskland). Förförstärkning kommer att utföras med TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technology, Darmstadt, Tyskland).
   • Analys av individuella miRNA av TaqMan-hydrolyssonder: Genuttryck kommer att bedömas med realtids-PCR med LightCycler 480 realtids-PCR-systemet (Roche Diagnostics, Barcelona, ​​Spanien), med hjälp av lämplig TaqMan-teknik för kvantifiering av relativ genuttryck.
10. Drosophila

Den relevanta tarmmikrobiotan som identifierats i den mänskliga kohorten kommer först att testas i Drosophila. Screening med hög genomströmning i Drosophila av de metaboliska och beteendemässiga effekterna av tarmmikrobiotan som identifierats hos möss med förlust av matningskontroll kommer att utföras. Mikrobiella stammar som erhålls från lagringsanläggningarna kommer att odlas med hög avkastning under förhållanden som är lämpliga för att välja ut aerotoleranta bakterier att associera med flugor. Dessa bakterier kommer att användas för att generera monoassocierade gnotobiotiska flugor, som kommer att analyseras för förändringar i utfodringsbeteende med hjälp av den kvantitativa flyPAD-matningsanalysen med hög genomströmning. Vi kommer att testa både fullmatade flugor och flugor utan aminosyror. Bakteriestammar som identifieras som modifierare av driften att äta kommer att utvärderas för deras effekter på flugmetabolism med hjälp av standardmetabolomiska metoder. Denna uppgift kommer att identifiera specifika bakteriestammar som kan modifiera matningsdriften och beteendemässiga och metaboliska svar hos Drosophila.

Informationen kommer att förbli registrerad i en anteckningsbok och kommer att datoriseras i studiens databas.

STATISKA METODER:

Provstorlek: Det finns inga tidigare data som visar förväntade skillnader för uppskattning av provstorlek avseende glukosvariabilitet, fysisk aktivitet, sammansättningen av tarmmikrobiota och kognitiv funktion. I en tidigare studie observerades skillnader i hjärnans järninnehåll hos 20 överviktiga mot 20 icke-överviktiga försökspersoner. Således är den föreslagna urvalsstorleken minst 20 individer per grupp, med balanserad ålder och kön (pre- och postmenopausala kvinnor) representation.

Elevens t-test för oberoende prover kommer att användas för att jämföra variablerna för försökspersoner med fetma vs försökspersoner utan fetma. Före statistisk analys kommer data att normaliseras med hjälp av specifika normaliseringsprocedurer. Därefter kommer normalfördelningen och homogeniteten av varianser att testas. Parametrar som inte uppfyller dessa krav kommer att transformeras logaritmiskt (log10). Elevens t-test för parade prover kommer att användas för att studera skillnader före och efter uppföljning. Signifikanta samband, vare sig de är positiva eller negativa, kommer att studeras vidare (enkel linjär och multivariat regressionsanalys).

Metagenomisk analys.

Råvärden kommer att transformeras med en centrerad logaritmisk transformation (clr) som implementeras i R-paketet "ALDEx2". Bakteriearter och funktioner associerade med hjärnjärn och cirkulerande mikroRNA kommer att identifieras med hjälp av robusta linjära regressionsmodeller som de implementerade i R-paketet. Limma R, justering för ålder, kroppsmassaindex, kön och utbildningsår. Taxa- och bakteriefunktioner kommer att filtreras i förväg så att endast de med fler än 10 avläsningar i minst fem prover kommer att väljas. P-värdena kommer att justeras för flera jämförelser med sekventiell god passform som implementerats i R-paketet "SGoF". SGoF har visat sig prestera särskilt bättre än FDR-metoder med ett stort antal tester och låg urvalsstorlek, vilket är fallet för stora omics-datauppsättningar. Statistisk signifikans kommer att sättas till p justerad

Kontinuerlig glukosövervakning

De glykemiska riskerna och mått på variabilitet som ska bedömas är standardavvikelse (SD), variationskoefficient (CV), medelamplitud av glykemiska exkursioner (MAGE), riskindex (RI), lågt blodsockerindex (LBGI) och högt blodsocker. glukosindex (HBGI). Dessutom procent (%) tid i intervallet (70-180 mg/dL), % tid i euglykemi (70 - 140 mg/dL), hypoglykemi (180 mg/dL). Mått på glykemivariabilitet beräknades med Matlab-programvara (R2018a).