Analiza histologiczna potencjału osteogennego dwufazowego fosforanu wapnia

Badanie zaprojektowano jako randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne. Warunkiem wzięcia udziału w badaniu jest posiadanie co najmniej jednego zęba predysponowanego do ekstrakcji oraz wszczepienie implantu stomatologicznego po zakończeniu okresu gojenia. Wskazaniami do ekstrakcji zęba są: przewlekły wyrostek okołowierzchołkowy, przewlekła choroba przyzębia czy złamanie kości pionowej. Kryteriami włączenia są: wiek od 18 do 60 lat, nienaruszony stan zdrowia fizycznego i psychicznego, pacjent musi zrozumieć protokół badania, pacjent musi podpisać świadomą zgodę. Z badania zostaną wykluczeni pacjenci, u których wystąpiło co najmniej jedno z bezwzględnych przeciwwskazań do leczenia implantoprotetycznego opisanych przez Wanga i Hwanga. Inne kryteria wykluczenia obejmowały następujące choroby ogólnoustrojowe: niekontrolowaną cukrzycę, osteoporozę i osteopenię oraz niedobór witaminy D, leczenie bisfosfonianami, leczenie glikokortykosteroidami, niedoczynność tarczycy, niekontrolowane choroby układu krążenia (nadciśnienie, choroba wieńcowa, zastoinowa niewydolność serca) oraz następujące czynniki miejscowe: palenie wyrobów tytoniowych (do 10 papierosów dziennie) i zła higiena jamy ustnej. Badania nie obejmują kobiet w ciąży i karmiących piersią.

Poza wymienionymi powyżej ogólnymi kryteriami zdrowotnymi, pacjent musi spełniać co najmniej jedno kryterium wewnątrzustne, a mianowicie obecność wady kości policzkowej, takiej jak fenestracja lub rozejście się. Pacjenci, którzy spełnili kryteria włączenia i wyrazili chęć udziału, są losowo przydzielani za pośrednictwem interfejsu internetowego (https://www.randomizer.org/).

Uczestnicy i materiały Uczestnicy będą rekrutowani z gabinetu chirurgii jamy ustnej. Do badania zostanie włączonych ogółem 36 zdrowych pacjentów. Analizując trafność testu, przyjęto podejście równoważności badanych metod i nie gorszej jakości badanej metody w porównaniu z metodą istniejącą. Przy poziomie istotności α 0,05, mocy testu 80%, oczekiwanym odchyleniu standardowym przewidywanego wyniku 10 i granicy równoważności d = 10, konieczne było włączenie do badania co najmniej 36 osób, 18 osób na grupę.

Łącznie 18 pacjentów w grupie testowej otrzyma I-BCP (Maxresorb® inject, Botiss GmbH, Berlin, Niemcy). Biomateriał ten to alloplastyczny materiał zastępczy kości w postaci pasty, który umieszcza się w ubytku za pomocą plastikowej strzykawki. Materiał składa się z wodnego żelu zawierającego granulki dwufazowego fosforanu wapnia w składzie 60% HA i 40% β-TCP (wielkość cząstek 15-50 nm). Pacjenci w grupie kontrolnej otrzymają BX (cerabone®, Botiss GmbH, Berlin, Niemcy). Materiał jest całkowicie nieorganiczny i składa się w 100% z HA. Do badań materiał zostanie użyty w postaci granulatu (wielkość granulek wynosi od 0,5 do 1 mm), zmieszanego z roztworem fizjologicznym przed umieszczeniem w ubytku.

Pierwsza faza chirurgiczna i okres gojenia. Przed zabiegiem pacjentowi podaje się 3% roztwór chlorheksydyny w celu płukania jamy ustnej przez jedną minutę. Następnie zostanie podane znieczulenie miejscowe (2% Lidocaine®, Belupo, Koprivnica, Chorwacja), a pole operacyjne zostanie przykryte sterylnymi serwetami. W miejscu ekstrakcji zostanie uniesiony płat śluzówkowo-okostnowy pełnej grubości. Aby ekstrakcja zęba była atraumatyczna, przed ekstrakcją korzenie zębów wielokorzeniowych zostaną oddzielone wiertłem. Ekstrakcja zostanie przeprowadzona przy użyciu narzędzi atraumatycznych, przy możliwie najmniejszym urazie zębodołu. Następnie dokładnie bada się pęcherzyki płucne i łyżeczkuje je w celu usunięcia granulek i stymulacji świeżego krwawienia z pęcherzyków płucnych. Wyrostek zębodołowy zostanie wypełniony aż po brzegi za pomocą I-BCP w grupie badanej i BX w grupie kontrolnej. Na koniec biomateriał do przeszczepu kości pokryty jest w obu grupach wchłanialną natywną błoną kolagenową uzyskaną z osierdzia świńskiego (membrana Jason®, Botiss GmbH, Berlin, Niemcy). Następnie płat śluzówkowo-okostnowy zostanie wyregulowany i zamknięty tak, aby błona kolagenowa była całkowicie pokryta tkanką miękką (monofilament 5.0). Pacjentowi zostanie wówczas przepisany lek przeciwbólowy (400 mg ibuprofenu) i zaleci przyjmowanie antybiotyków (amoksycyliny z kwasem klawulanowym lub klindamycyny) przez kolejne 7 dni. W 10. dobie po zabiegu usuwa się szwy.

Następuje 6-miesięczny okres regeneracji ubytku kostnego. Na podstawie badania radiograficznego zostanie dokonany dobór i umiejscowienie odpowiedniego implantu.

Druga faza chirurgiczna Sześć miesięcy po ekstrakcji pacjenci zgłaszają się do gabinetu w celu wszczepienia implantu stomatologicznego (Ankylos®, Dentsply Sirona, Charlotte, USA) w obszarze augmentowanym. Przygotowanie pacjenta (płukanie jamy ustnej roztworem antyseptycznym, znieczulenie miejscowe, sterylne pokrycie pola operacyjnego) przebiega tak samo jak przy pierwszym zabiegu operacyjnym. Następnie podnosi się płat pełnej grubości i pobiera się biopsję powiększanego obszaru do analizy histologicznej przy użyciu wiertła trepanowego (średnica wewnętrzna 2,5 mm; Ustomed® intrumente, Tuttlingen, Niemcy). Należy podkreślić, że średnica wewnętrzna wiertła trepanacyjnego jest mniejsza niż średnica wiertła końcowego używanego do przygotowania łoża implantu, aby uniknąć niepotrzebnego usuwania kości pacjenta. Ponadto każda biopsja zostanie pobrana z centralnej części augmentowanego obszaru, aby zmniejszyć ryzyko nieprawidłowej biopsji (np. biopsja wyłącznie kości natywnej, która nie została augmentowana biomateriałem).

Analiza histologiczna Wiertło trepanowe zostanie umieszczone w hermetycznie zamkniętej plastikowej rurce zawierającej 4% roztwór formaldehydu i przesłane do laboratorium histologicznego w celu dalszej analizy. Tkankę utrwala się w 4% roztworze formaldehydu na dwa tygodnie. Następnie biopsje będą przechowywane w 25% kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (Decalcifier soft®, Solvagreen®, Karlsruhe, Austria), który służy do delikatnego odwapnienia kości. Po odwapnieniu tkanka zostanie poddana standardowemu protokołowi w procesorze tkanek (MTP, SLEE Medical GmbH, Moguncja, Niemcy). Następnie nastąpi utworzenie bloków parafinowych (MPS/P, SLEE Medical GmbH, Moguncja, Niemcy). Z każdej biopsji zostanie przygotowanych sześć kolejnych skrawków o grubości 5 μm przy użyciu mikrotomu obrotowego (CUT 4062, SLEE Medical GmbH, Moguncja, Niemcy). Próbki zostaną następnie wybarwione barwnikiem trichromowym Masson i barwnikiem pentachromowym Movat. Mikroskopia preparatów zostanie przeprowadzona przy użyciu mikroskopu świetlnego (Leica DMRB, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy) w połączeniu z kamerą wideo (Axio Imager M2, Zeiss, Oberkochen, Niemcy). Analiza patohistologiczna oceni odpowiedź tkanki na wszczepiony biomateriał, tj. obecność fibroblastów, naczyń krwionośnych, neutrofili, monocytów/makrofagów i wielojądrzastych komórek olbrzymich (MGC).

Przetwarzanie histomorfometryczne próbek zostanie przeprowadzone przy użyciu bezpłatnego oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Na próbkach zaznaczona zostanie powierzchnia nowej kości, powierzchnia biomateriału i powierzchnia tkanki miękkiej. Następnie zostanie zmierzona powierzchnia próbki i na podstawie uzyskanych danych obliczone zostaną następujące dane: procent utworzonej nowej kości, procent pozostałego biomateriału i procent tkanki miękkiej.

Analiza statystyczna Zmienne kategoryczne będą podawane z częstotliwością bezwzględną i względną. Różnice pomiędzy zmiennymi kategorycznymi badano za pomocą testu Fishera-Freemana-Haltona.

Normalność rozkładu będzie badana za pomocą testu Shapiro-Wilka. Dane ciągłe będą opisywane średnią arytmetyczną i odchyleniem standardowym. Różnice w zmiennych ciągłych zostaną sprawdzone za pomocą testu U Manna-Whitneya (z odpowiednią różnicą i 95% przedziałem ufności różnicy).

Wszystkie wartości P będą dwustronne. Poziom istotności ustalono na poziomie alfa = 0,05. Oprogramowanie IBM SPSS Statistical wersja 27.0.1, zostaną wykorzystane do analizy.