Картирование стволовых клеток опухоли в области резекции при экстирпации высокозлокачественных глиом с помощью GlioStem (CeNo2)

Актуальность темы Глиобластома (GBM) является наиболее злокачественной первичной опухолью головного мозга с ежегодной заболеваемостью около 3 случаев на 100 000 человек. Опухоли часто обнаруживаются на поздних стадиях заболевания, и медиана выживаемости пациентов без лечения составляет всего 3 месяца. Современное лечение включает максимальную хирургическую резекцию с последующей сопутствующей радиохимиотерапией. Однако, несмотря на современное лечение, прогноз остается неблагоприятным, а медиана выживаемости составляет менее двух лет. При рецидиве не существует стандарта лечения, и дальнейшее лечение, включая повторную операцию, повторную химиотерапию или бевацизумаб, обеспечивает лишь очень ограниченное увеличение продолжительности жизни.

Новые исследования показывают, что неспособность воздействовать на стволовые клетки глиомы (GSCs), а не невозможность удаления опухолей с помощью хирургического вмешательства, облучения или химиотерапии, объясняет плохую выживаемость пациентов с глиомой. Убедительно показано, что ГСК обладают способностью инициировать опухоль. ГСК также, кажется, избегают традиционной терапии из-за их медленного метаболизма, и они могут находиться в состоянии покоя в течение длительного времени. ГСК могут проникать в здоровую ткань из самой опухоли, что представляет собой сложную задачу для хирурга, поскольку здоровые клетки и ГСК невозможно различить в режиме реального времени с помощью флуоресцентной резекции с 5-аминолевулиновой кислотой (5-АЛК) или другими проверенными методами или другими проверенными методами. Кроме того, поскольку известно, что ГСК устойчивы к химио- и лучевой терапии, а нацеливание на ГСК значительно снижает риск летального рецидива, возможность обнаружения и устранения ГСК во время резекции опухоли будет означать решающий шаг на пути к увеличению выживаемости пациентов. Следовательно, существует потребность в более совершенных методах точного удаления ГСК с минимальным повреждением здоровых тканей для улучшения прогноза ГБМ и качества жизни оперированных пациентов.

Другие исследования in vitro и на животных моделях указали на важность GSCs для рецидива и резистентности к терапии глиом. Таким образом, целенаправленное воздействие на эти клетки или участки опухоли, особенно плотные в таких инициирующих опухоль клетках, либо макроскопически во время хирургической процедуры, либо с помощью лекарственных средств, нацеленных на эти субпопуляции клеток, может быть важной целью эффективного предотвращения повторного роста опухоли.

Основная технология Cellluminova основана на молекулярном люминесцентном биомаркере GlioStem, который, в отличие от 5-АЛК, указывает на ГСК. GlioStem — это производное олиготиофена, полученное в результате исследований в KI и Университете Линчепинга (LiU), которое может проникать через физиологические клеточные мембраны и избирательно связываться со структурами внутри GSC. GlioStem удобно вводить пипеткой в ​​исследуемую ткань или клеточную культуру. Всего через несколько минут GSC будут излучать зеленый свет от молекул GlioStem под синим освещением. Высокая специфичность люминесценции ГСК была подтверждена в крупных исследованиях in vitro, в том числе на большом количестве клеток человека и животных, а также на животных моделях. Кроме того, мы показали, что высокая специфичность GlioStem позволяет эффективно отделять GSC от астроцитов и других клеток GBM с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Поскольку GlioStem обнаруживает покоящиеся медленно делящиеся GSC, которые не обнаруживаются с помощью Gliolan или другими методами, он может предоставить ценную дополнительную информацию для Gliolan во время резекции опухоли под флуоресцентным контролем. Как упоминалось ранее, известно, что ГСК устойчивы к химио- и лучевой терапии. Таким образом, возможность обнаружения и устранения ГСК во время резекции опухоли будет означать решающий шаг к увеличению выживаемости пациентов.

В предыдущих исследованиях мы показали, что маркер раковых стволовых клеток GlioStem может эффективно и с высокой специфичностью идентифицировать опухолевые клетки с генотипом стволовых клеток в образцах тканей из ГБМ (неопубликованные данные). Теперь мы намерены изучить, в какой степени это можно использовать для руководства процедурой резекции опухоли, чтобы определить области в маргинальной зоне, где могут быть идентифицированы раковые стволовые клетки и где расширенная резекция была бы особенно полезной.

План и методы проекта

Мы соберем образцы тканей после хирургической резекции вновь диагностированных или рецидивирующих опухолей головного мозга в отделении нейрохирургии Каролинской университетской больницы. Мы будем собирать образцы из диффузных астроцитарных и олигодендроглиальных опухолей головного мозга человека II-IV степени ВОЗ у взрослых. Образцы будут псевдонимизированы. Образцы ткани будут взяты из пролиферирующей периферической части опухоли, богатой жизнеспособными опухолевыми клетками, а также небольшие образцы ткани из пограничной зоны сразу за плоскостью рассечения.

Клинические параметры, которые будут собраны, включают:

• Возраст
• Пол
• Диагноз
• Протокол лечения
• Выживаемость без прогрессирования
• Общая выживаемость
• Статус гистопатологически важных маркеров, таких как IDH1, MGMT, EGFR, p53, BRAF и других маркеров
• Место опухоли

Мы проведем секвенирование РНК одиночных клеток с использованием анализа 10x Genomics Chromium, собрав данные транскриптома примерно для 10 000 отдельных клеток на образец. Для ряда образцов мы проведем сортировку клеток с помощью флуоресценции (FACS, RT-PCR и анализ микрочипов).

Этот набор данных будет проанализирован, чтобы (1) охарактеризовать фенотипы отсортированных клеточных популяций с помощью микроматрицы экспрессии генов для сравнения с генотипированием опухоли и (2) оценить гетерогенность опухоли и состав стволовых клеток для каждой клетки и ( 3) Оценить корреляцию различий в экспрессии генов (фенотип) между клеточными популяциями в образце опухоли с генотипом. Наша цель состоит в том, чтобы получить подробную картину экспрессии генов в отдельных клетках, предоставляя дополнительную информацию к усредненным данным о генотипе для целых клеточных популяций. Эти данные будут проанализированы на наличие пространственных областей или субклонов клеток с паттернами экспрессии генов, указывающими на «инициирующий опухоль» или фенотип, подобный стволовым клеткам, чтобы понять, как эти клеточные клоны, которые, как считается, вызывают рецидив опухоли, пространственно распределены и как методы лечения конкретно нацелены эти клетки могут быть спроектированы.

Мы проведем иммунофлуоресцентную микроскопию образцов тканей с использованием маркера стволовых клеток GlioStem (разработка Cellluminova AB). Этот маркер можно наносить на биопсию ткани и специально окрашивать опухолевые клетки, подобные стволовым клеткам, в глиомах. Мы будем исследовать, может ли это надежно идентифицировать области в образцах опухолевой ткани, которые плотны с такими GSC. Если это так, то в будущем этот маркер потенциально может быть разработан для введения пациентам во время операции, что позволит хирургу уже во время операции иметь возможность идентифицировать области, обогащенные клетками, способными вызывать рецидив опухоли. Это также будет информативно для диагностических и прогностических целей.

Цели

• Общая цель состоит в том, чтобы обнаружить и визуализировать клетки, подобные стволовым клеткам, с использованием биомаркеров или на основе генетического материала или белков опухолей, тем самым разрабатывая улучшенные стратегии лечения пациентов с опухолями головного мозга и, в конечном итоге, улучшая выживаемость и качество жизни этих пациентов. пациенты.
• Охарактеризуйте пространственное присутствие стволовых клеток в опухолях и на их периферии.
• Составьте карту, существуют ли какие-либо молекулярные или генетические различия между опухолевыми стволовыми клетками в центральной опухоли и стволовыми клетками на периферии. В конечном итоге это может быть использовано для определения областей опухоли, которые особенно важно удалить во время операции.
• Изучение того, можно ли надежно визуализировать раковые стволовые клетки или другие клетки, инициирующие опухоль, с использованием методов иммунофлуоресценции, которые потенциально могут быть разработаны для интраоперационного использования.
• Составьте карту состава опухолей головного мозга на клеточном уровне с целью обнаружения белков (генов), которые активны в опухолевых клетках, но не в нормальных клетках головного мозга. Также важно картировать механизмы передачи сигналов между опухолевыми клетками.
• Разработка специфических маркеров (например, флуоресцентные молекулы), которые могут идентифицировать опухолевую ткань и, в оптимальных случаях, конкретно опухолевые клетки, необходимые для роста опухоли.
• Картирование пространственного распределения экспрессии генов для понимания региональных различий в опухолях в отношении подтипов клеток и склонности к пролиферации опухоли.