Mapování nádorových kmenových buněk v resekčním okraji při exstirpaci vysoce maligních gliomů pomocí GlioStemu (CeNo2)

Pozadí Glioblastom (GBM) je nejzhoubnější primární mozkový nádor s roční incidencí přibližně 3 na 100 000. Nádory jsou často nalezeny v pozdní fázi onemocnění a neléčení pacienti mají medián přežití pouze 3 měsíce. Současná nejmodernější léčba zahrnuje maximální chirurgickou resekci s následnou konkomitantní radiochemoterapií. Navzdory nejmodernější léčbě však zůstává prognóza tristní s mediánem přežití méně než dva roky. V případě recidivy neexistuje standardní péče a další léčba včetně obnovené operace, opětovného nasazení chemoterapie nebo bevacizumabu nabízí pouze velmi omezené prodloužení přežití.

Rozvíjející se výzkum naznačuje, že špatné přežití pacientů s GBM vysvětluje spíše selhání cílení na gliomové kmenové buňky (GSC) než neschopnost odstranit nádory chirurgicky, ozařováním nebo chemoterapií. Je přesvědčivě prokázáno, že GSC mají schopnost iniciovat nádor. Zdá se, že GSC také unikají konvenční terapii kvůli jejich pomalému metabolismu a mohou být po dlouhou dobu v klidových stavech. GSC se mohou rozšířit do zdravé tkáně ze skutečného nádoru, což je pro chirurga náročné, protože zdravé buňky a GSC nelze v reálném čase rozlišit fluorescenčně řízenou resekcí 5-aminolevulové kyseliny (5-ALA) nebo jinými osvědčenými metodami nebo jinými osvědčenými metodami. Kromě toho, protože je známo, že GSC jsou rezistentní na chemoterapii a radioterapii – a cílení na GSC významně snižuje riziko letálního relapsu – schopnost detekovat a eliminovat GSC během resekce nádoru by znamenala zásadní krok ke zvýšení přežití pacientů. Existuje tedy potřeba lepších metod pro přesné odstranění GSC s minimálním poškozením zdravé tkáně, aby se zlepšila prognóza GBM a kvalita života operovaných pacientů.

Jiné studie in vitro a na zvířecích modelech poukázaly na význam GSC pro recidivu a rezistenci gliomů na léčbu. Specifické cílení na tyto buňky nebo oblasti nádoru specificky husté v takových buňkách iniciujících nádor - buď makroskopicky během chirurgického zákroku nebo pomocí léků specificky zaměřených na tuto subpopulaci buněk - proto může být důležitým cílem při účinné prevenci opětovného růstu nádoru.

Základní technologie Celluminova je soustředěna kolem molekulárního luminiscenčního biomarkeru GlioStem, který na rozdíl od 5-ALA ukazuje na GSC. GlioStem je oligothiofenový derivát vycházející z výzkumu na KI a Linköping University (LiU), který může pronikat fyziologickými buněčnými membránami a selektivně se váže na struktury uvnitř GSC. GlioStem se pohodlně aplikuje do zkoumané tkáně nebo buněčné kultury pomocí pipety. Již po několika minutách budou GSC emitovat zelené světlo z molekul GlioStem pod modrým osvětlením. Vysoká luminiscenční specificita pro GSC byla ověřena ve velkých studiích in vitro, včetně velkého množství lidských a zvířecích buněk, a na zvířecích modelech. Navíc jsme ukázali, že vysoká specificita GlioStem umožňuje účinnou separaci GSC od astrocytů a dalších GBM buněk pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS). Protože GlioStem detekuje klidové pomalu se dělící GSC, které nejsou pozorovány pomocí Gliolanu nebo jinými metodami, může poskytnout cenné doplňkové informace ke Gliolan během fluorescenčně řízené resekce nádoru. Jak již bylo zmíněno, je známo, že GSC jsou odolné vůči chemo- a radioterapii. Schopnost detekovat a eliminovat GSC během resekce nádoru by tedy znamenala zásadní krok ke zvýšení přežití pacientů.

V předchozích studiích jsme ukázali, že marker rakovinných kmenových buněk GlioStem dokáže účinně a s vysokou specificitou identifikovat nádorové buňky s genotypem kmenových buněk ve vzorcích tkání z GBM (nepublikovaná data). Nyní máme v úmyslu studovat, do jaké míry to může být použito k vedení postupu při resekci nádoru k identifikaci oblastí v okrajové zóně, kde lze identifikovat kmenové buňky zhoubného nádoru a kde by byla rozšířená resekce zvláště přínosná.

Plán a metody projektu

Odebereme vzorky tkáně z chirurgické resekce nově diagnostikovaných nebo recidivujících mozkových nádorů na Neurochirurgické klinice FN Karolinska. Budeme odebírat vzorky z difuzních astrocytárních a oligodendrogliálních lidských mozkových nádorů WHO stupně II-IV u dospělých. Ukázky budou pseudonymizovány. Vzorky tkání budou odebírány z proliferující periferní části nádoru, která je bohatá na životaschopné nádorové buňky, a také vzorky malých tkání z hraniční zóny těsně mimo rovinu disekce.

Klinické parametry, které budou shromažďovány, zahrnují:

• Stáří
• Rod
• Diagnóza
• Léčebný protokol
• Přežití bez progrese
• Celkové přežití
• Stav histopatologicky významných markerů jako IDH1, MGMT, EGFR, p53, BRAF a dalších markerů
• Místo nádoru

Provedeme jednobuněčné sekvenování RNA pomocí testu 10x Genomics Chromium, přičemž shromáždíme transkriptomová data pro přibližně 10 000 jednotlivých buněk na vzorek. U řady vzorků provedeme fluorescenční třídění buněk (FACS, RT-PCR a microarray analýza).

Tento soubor dat bude analyzován za účelem (1) charakterizace fenotypů tříděných buněčných populací pomocí mikročipu genové exprese pro srovnání s genotypizací nádoru a (2) posouzení heterogenity nádoru a složení kmenových buněk na bázi buňky po buňce a ( 3) Posuďte korelaci rozdílů v genové expresi (fenotypu) mezi buněčnými populacemi ve vzorku nádoru a genotypem. Naším cílem je získat podrobný obraz o genových expresích jednotlivých buněk a poskytnout doplňující informace ke zprůměrovaným genotypovým datům pro celé buněčné populace. Tato data budou analyzována pro prostorové oblasti nebo subklony buněk se vzory genové exprese naznačujícími „nádor iniciující“ nebo fenotyp podobný kmenovým buňkám, abychom pochopili, jak jsou tyto buněčné klony, o kterých se předpokládá, že propagují recidivu nádoru, prostorově distribuovány a jak jsou terapie specificky zaměřeny tyto buňky by mohly být navrženy.

Provedeme imunofluorescenční mikroskopii tkáňových vzorků pomocí markeru kmenových buněk GlioStem (vyvinutý společností Celluminova AB). Tento marker může být aplikován na tkáňové biopsie a specificky barví nádorové buňky podobné kmenovým buňkám v gliomech. Budeme zkoumat, zda to může spolehlivě identifikovat oblasti ve vzorcích nádorové tkáně, které jsou husté s takovými GSC. Pokud ano, tento marker by mohl být potenciálně v budoucnu vyvinut pro podávání pacientům během operace, což by chirurgovi umožnilo již během operace identifikovat oblasti obohacené buňkami se sklonem k recidivám nádoru. To bude také informativní pro diagnostické a prognostické účely

Cíle

• Celkovým cílem je detekovat a vizualizovat buňky podobné kmenovým buňkám pomocí biomarkerů nebo na základě nádorového genetického materiálu nebo proteinů, a tím vyvinout vylepšené léčebné strategie pro pacienty s mozkovými nádory a v dlouhodobém horizontu zlepšit přežití a kvalitu života těchto pacientů. pacientů.
• Charakterizujte prostorovou přítomnost buněk podobných kmenovým buňkám v nádorech a jejich periferii.
• Zmapujte, zda existují nějaké molekulární nebo genetické rozdíly mezi nádorovými kmenovými buňkami v centrálním nádoru ve srovnání s kmenovými buňkami na periferii. To by mohlo být v dlouhodobém horizontu použito k identifikaci oblastí v nádoru, které je zvláště důležité odstranit během operace.
• Zkoumání, zda by rakovinné kmenové buňky nebo jiné buňky iniciující nádor mohly být spolehlivě vizualizovány pomocí imunofluorescenčních technik, které by mohly být potenciálně vyvinuty pro intraoperační použití.
• Zmapujte složení mozkových nádorů na buněčné úrovni s cílem najít proteiny (geny), které jsou aktivní v nádorových buňkách, ale ne v normálních buňkách v mozku. Důležité je také zmapování signálních mechanismů mezi nádorovými buňkami.
• Vývoj specifických markerů (např. fluorescenční molekuly), které dokážou identifikovat nádorovou tkáň a v optimálních případech konkrétně nádorové buňky, které jsou nezbytné pro růst nádoru.
• Mapování prostorové distribuce genové exprese pro pochopení regionálních rozdílů v rámci nádorů s ohledem na podtypy buněk a sklon řídit proliferaci nádorů.