Kartlegging av tumorstamceller i reseksjonsmarginen under eksstirpasjon av svært ondartede gliomer ved bruk av GlioStem (CeNo2)

Bakgrunn Glioblastom (GBM) er den mest ondartede primære hjernesvulsten med en årlig forekomst på rundt 3 av 100 000. Svulstene finnes ofte i et sent stadium av sykdommen og ubehandlede pasienter har en median overlevelse på kun 3 måneder. Nåværende toppmoderne behandling inkluderer maksimal kirurgisk reseksjon, etterfulgt av samtidig radiokjemoterapi. Til tross for toppmoderne behandling forblir prognosen dyster med median overlevelse på mindre enn to år. Ved tilbakefall er det ingen standard for behandling, og videre behandling inkludert fornyet kirurgi, gjentatt kjemoterapi eller bevacizumab gir kun svært begrenset overlevelsesforlengelse.

Ny forskning tyder på at manglende målretting mot gliomstamceller (GSCs) snarere enn manglende evne til å fjerne svulster gjennom kirurgi, stråling eller kjemoterapi, forklarer den dårlige overlevelsen til GBM-pasienter. Det er overbevisende demonstrert at GSC-er har tumorinitierende evner. GSC-er ser også ut til å unnslippe konvensjonell terapi på grunn av deres langsomme metabolisme, og de kan være i rolige tilstander i lange tider. GSC-er kan strekke seg inn i det friske vevet fra den faktiske svulsten, noe som er utfordrende for kirurgen ettersom de friske cellene og GSC-ene ikke kan skilles i sanntid med 5-aminolevulinsyre (5-ALA) fluorescensveiledet reseksjon eller andre velprøvde metoder eller med andre velprøvde metoder. Videre, siden det er kjent at GSCs er resistente mot kjemo- og strålebehandling - og målretting av GSCs reduserer risikoen for dødelig tilbakefall betydelig - vil det å kunne oppdage og eliminere GSCs under tumorreseksjon bety et avgjørende skritt mot økt pasientoverlevelse. Derfor er det behov for bedre metoder for presis fjerning av GSC-er med minimal skade på sunt vev for å forbedre GBM-prognosen og livskvaliteten til opererte pasienter.

Andre studier in vitro og i dyremodeller har pekt på viktigheten av GSCs for tilbakefall og terapiresistens av gliomer. Å målrette disse cellene spesifikt eller tumorregioner som er spesifikt tette i slike tumorinitierende celler - enten makroskopisk under en kirurgisk prosedyre eller med legemidler spesifikt rettet mot disse subpopulasjonene av celler - kan derfor være et viktig mål for å effektivt forhindre tumorgjenvekst.

Celluminovas kjerneteknologi er sentrert rundt den molekylære selvlysende biomarkøren GlioStem, som, i motsetning til 5-ALA, er en indikasjon på GSC-er. GlioStem er et oligotiofenderivat fra forskning ved KI og Linköpings universitet (LiU), som kan penetrere fysiologiske cellemembraner og selektivt binder seg til strukturer inne i GSC-ene. GlioStem administreres enkelt på det undersøkte vevet eller cellekulturen med en pipette. Etter bare noen få minutter vil GSC-ene sende ut grønt lys fra GlioStem-molekyler under blå belysning. Den høye luminescensspesifisiteten for GSC-ene er verifisert i store in vitro-studier, inkludert et stort utvalg av menneske- og dyreceller, og i dyremodeller. Videre har vi vist at den høye GlioStem-spesifisiteten tillater effektiv separasjon av GSC-er fra astrocytter og andre GBM-celler ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Ettersom GlioStem oppdager de stillegående saktedelte GSC-ene som ikke sees med Gliolan eller ved andre metoder, kan det gi verdifull komplementær informasjon til Gliolan under fluorescerende-veiledet tumorreseksjon. Som tidligere nevnt er det kjent at GSC-er er resistente mot kjemo- og strålebehandling. Derfor vil det å kunne oppdage og eliminere GSCs under tumorreseksjon bety et avgjørende skritt mot økt pasientoverlevelse.

I tidligere studier har vi vist at kreftstamcellemarkøren GlioStem effektivt og med høy spesifisitet kan identifisere tumorceller med stamcellegenotype i vevsprøver fra GBM (upubliserte data). Vi har nå til hensikt å studere i hvilken grad dette kan brukes til å veilede prosedyren i en tumorreseksjon for å identifisere områder i randsonen hvor kreftstamceller kan identifiseres og hvor utvidet reseksjon vil være spesielt gunstig.

Prosjektplan og metoder

Vi vil samle inn vevsprøver fra kirurgisk reseksjon av nydiagnostiserte eller tilbakevendende hjernesvulster, ved nevrokirurgisk avdeling, Karolinska Universitetssykehuset. Vi vil samle inn prøver fra diffuse astrocytiske og oligodendrogliale humane hjernesvulster WHO grad II-IV hos voksne. Prøver vil bli pseudonymisert. Det vil bli tatt vevsprøver fra den prolifererende perifere delen av svulsten som er rik på levedyktige tumorceller, samt små vevsprøver fra kantsonen rett utenfor disseksjonsplanet.

Kliniske parametere som vil bli samlet inn inkluderer:

• Alder
• Kjønn
• Diagnose
• Behandlingsprotokoll
• Progresjonsfri overlevelse
• Total overlevelse
• Status for histopatologisk viktige markører som IDH1, MGMT, EGFR, p53, BRAF og andre markører
• Sted for svulst

Vi vil utføre enkeltcelle-RNA-sekvensering ved å bruke 10x Genomics Chromium-analysen, og samle transkriptomdata for omtrent 10 000 enkeltceller per prøve. For en rekke prøver vil vi utføre fluorescensassistert cellesortering (FACS, RT-PCR og mikroarray-analyse).

Dette datasettet vil bli analysert for å (1) karakterisere fenotypene til sorterte cellepopulasjoner etter genekspresjonsmikroarray for å sammenligne med genotypingen av svulsten og, (2) vurdere tumorheterogenitet og stamcellesammensetning på celle-for-celle basis og ( 3) Vurder korrelasjonen mellom forskjellene i genuttrykk (fenotype) mellom cellepopulasjonene i en tumorprøve og genotypen. Målet vårt er å få et detaljert bilde av genuttrykkene til individuelle celler, som gir komplementær informasjon til gjennomsnittlig genotypedata for hele cellepopulasjonene. Disse dataene vil bli analysert for romlige regioner eller subkloner av celler med genekspresjonsmønstre som indikerer en "tumor-initierende" eller stamcelle-lignende fenotype, for å forstå hvordan disse celleklonene som antas å forplante tumorresidiv er romlig fordelt og hvordan terapier spesifikt retter seg mot disse cellene kan utformes.

Vi vil utføre immunfluorescensmikroskopi av vevsprøver ved hjelp av stamcellemarkøren GlioStem (utviklet av Celluminova AB). Denne markøren kan brukes på vevsbiopsier, og farger spesifikt stamcellelignende tumorceller i gliomer. Vi vil undersøke om dette pålitelig kan identifisere regioner i tumorvevsprøver som er tette med slike GSC-er. I så fall kan denne markøren potensielt i fremtiden utvikles for pasientadministrasjon under operasjonen, slik at kirurgen allerede intraoperativt kan identifisere regioner beriket med celler med en tilbøyelighet til å drive tilbakevendende tumor. Dette vil også være informativt for diagnostiske og prognostiske formål

Mål

• Det overordnede målet er å oppdage og visualisere stamcelle-lignende celler ved hjelp av biomarkører eller basert på svulsters genetiske materiale eller proteiner, for derved å utvikle forbedrede behandlingsstrategier for pasienter med hjernesvulster, og på sikt forbedre overlevelsen og livskvaliteten til disse. pasienter.
• Karakteriser den romlige tilstedeværelsen av stamcellelignende celler i svulster og deres periferi.
• Kartlegg om det er noen molekylære eller genetiske forskjeller mellom tumorstamceller i sentral svulst sammenlignet med stamceller i periferien. Dette vil på sikt kunne brukes til å identifisere områder i svulsten som er spesielt viktige å fjerne under operasjonen.
• Undersøke om kreftstamceller eller andre tumorinitierende celler kunne visualiseres pålitelig ved hjelp av immunfluorescensteknikker som potensielt kan utvikles for intraoperativ bruk.
• Kartlegge sammensetningen av hjernesvulster på cellenivå, med mål om å finne proteiner (gener) som er aktive i tumorceller men ikke i normale celler i hjernen. Det er også viktig å kartlegge signalmekanismer mellom tumorceller.
• Utviklingen av spesifikke markører (f.eks. fluorescerende molekyler) som kan identifisere tumorvev og, i optimale tilfeller, spesifikt tumorcellene som er avgjørende for tumorvekst.
• Kartlegging av romlig fordeling av genuttrykk for å forstå regionale forskjeller innen svulster med hensyn til undertyper av celler og tilbøyelighet til å drive tumorproliferasjon.