美国成年人死亡时的维生素 A 肝脏储备和维生素 A 血清标志物

与血液生物标志物相比，关于实际肝脏维生素 A 的人类数据很少。 一种血液生物标志物，即以视黄酯形式存在的总血清视黄醇（维生素 A）的百分比，已被建议用于诊断维生素 A 过多症，截断值为 5% 和 10%。 在这项研究中，研究人员旨在使用来自美国成年人的尸体解剖样本，比较肝脏总维生素 A 储备与总血清视黄醇作为视黄酯的百分比，以评估维生素 A 过多症。 研究人员还评估了血清视黄醇的敏感性（生物标志物正确识别缺乏者的能力）和特异性（生物标志物正确识别无缺陷者的能力），以确定维生素 A 缺乏、肝叶间维生素 A 浓度的变化和肝脏α-视黄酯浓度，α-胡萝卜素的裂解产物，一种维生素 A 前体。

为进行这项研究，从 27 具美国成年尸体（来自年龄在 49-101 岁的捐赠者）中采集了匹配的血清和肝脏样本，并分析了它们的维生素 A 生物标志物。 从 27 具尸体（13 具男性和 14 具女性）中收集匹配的人类肝脏和血清样本，并通过向国家疾病研究交流服务中心提出请求作为连续样本获取。 还获得了去标识化的临床病史摘要。 供体标准如下：对种族或性别没有限制，没有化疗和/或放疗史，没有长期气管插管或通气史，没有败血症或传染病的证据（阴性血清学小组），年龄范围为 21 岁-54 岁、55-74 岁和 >75 岁（目标收集是每个年龄范围的 5 名男性和 5 名女性捐赠者，以提供非均质样本）。 在每个年龄范围（即 55-74 岁和 >75 岁）获得 10 个人后，不再要求提供样本。 从 2013 年 9 月到 2016 年 8 月，所有组织和血清均在死后 16 小时内采购。 冷冻肝脏、包埋肝脏和血清的采购协议编号分别为 DWEN1 002 022、002 023 和 002 024。 通过凝胶分离分离血清样品，然后冷冻；原代肝脏样本在液氮中快速冷冻；来自每个供体的第二个肝脏样本被包埋在最佳切割温度化合物 (OCT) 中，并在低温模具中快速冷冻。 获得了几乎完整的两个肝脏，并评估了叶内和叶间的 VA 分布。 样品用干冰运送到威斯康星州麦迪逊，并储存在 -80°C 的冰箱中。

使用低温恒温器将 OCT 包埋的肝脏样本制备为 5 µm 冷冻切片，并使用常规苏木精和伊红以及 Masson 的三色方案和试剂（Newcomer Supply，Middleton，WI）进行染色。 使用 Nikon E-600 明场显微镜（Melville, NY）和 Olympus DP-71 数码显微相机（Center Valley, PA）拍摄图像。 对用于 VA 和类胡萝卜素分析的肝脏样品 (1 g) 进行称重，然后使用已发表的方法稍作修改，用硫酸钠 (4-5 g) 在研钵和研杵中研磨。 添加纯化的 C-23 β-载脂蛋白-胡萝卜素以确定提取效率。 用二氯甲烷反复提取样品，并通过 WhatmanTM #1（GE Healthcare Life Sciences，Pittsburgh，PA）过滤到 50 mL 容量瓶中。 等分试样 (5 mL) 在氮气下干燥，重新溶解在 300 µL 甲醇：二氯乙烷（75:25，体积：体积）中，并将 1 µL 等分试样注入 Waters Acquity H-Class 超高压液相色谱仪（ UPLC®) 系统配备光电二极管阵列检测器（米尔福德，马萨诸塞州）。 等分试样被进一步皂化以定量总α-视黄醇，如下所述用于叶分析。 对于肝叶样本评估，从每个可用的肝叶中一式三份提取 1 g 样本。 将 5 mL 等分试样的提取物用 400 mL 氢氧化钾：水（50:50，重量：体积）在 45°C 下皂化 1 小时。 用 0.5 mL 水淬灭反应并用 0.5 mL 己烷萃取三次。 收集己烷层并在氮气下干燥，重新溶解在 150 µL 甲醇：二氯乙烷（75:25，体积：体积）中，并将 1 µL 等分试样注入 UPLC® 系统。

将血清样品 (0.5 mL) 等分到试管中用于视黄醇和 RE 测定；添加 1.25 X 体积的乙醇以变性蛋白质。 内标为 C23-β-apo-胡萝卜素。 样品用 0.75 mL 己烷萃取 3 次；收集上清液部分并在氮气下干燥，然后在 100 µL 甲醇：二氯乙烷（75:25，体积：体积）中重构。 在下述条件下将 2 µL 注入 UPLC®。 使用 ELISA 试剂盒（CRP：Cayman Chemical Company；AGP：Abcam）分析血清 C 反应蛋白 (CRP) 和 α1-酸性糖蛋白 (AGP) 以评估炎症。 番茄红素和α-和β-胡萝卜素的浓度通过常规HPLC 分析确定。

超高效液相色谱 (UPLC) 方法 Waters Acquity UPLC HSS C18 1.8 µm VanGuard 预柱与 Waters Acquity UPLC® HSS C18 色谱柱（1.8 µm，2.1 x 150 mm）结合使用。 该方法使用两种混合溶剂，梯度为 29 分钟。 溶剂 A 为乙腈-水-异丙醇（70:25:5，体积：体积：体积）和 10 mmol/L 乙酸铵，溶剂 B 为甲醇-异丙醇（75:25，体积：体积）。 柱温设置为 32°C，流速为 0.4 mL/min。 梯度从 100% 溶剂 A 保持 7 分钟开始，然后线性过渡到 5% A 4 分钟，然后在 12 分钟内再次过渡到 1% A。 然后在 2 分钟内将溶剂梯度反转为 100% A，并平衡 4 分钟。 α-视黄醇和 α-RE 的色谱图在 311 nm 处生成，视黄醇和 RE 的色谱图在 325 nm 处生成，类胡萝卜素的色谱图在 450 nm 处生成。 几乎完全来自饮食中的 β-胡萝卜素的 alpha-RE 被量化为长期蔬菜暴露的代表。 使用源自真正的 HPLC 纯化的 α-视黄醇和视黄醇标准品的标准曲线计算浓度。