死亡時の米国成人におけるビタミンAの肝臓の貯蔵量とビタミンAの血清マーカー

血液バイオマーカーと比較して、実際の肝臓ビタミン A に関する人間のデータはほとんどありません。 1 つの血液バイオ マーカー、レチニル エステルの形で総血清レチノール (ビタミン A) の割合は、5% と 10% のカットオフでビタミン A 過剰症を診断するために提案されています。 この研究では、研究者は、米国の成人からの剖検サンプルを使用して、ビタミンA過剰症を評価するために、レチニルエステルとしての総肝臓ビタミンA貯蔵量と総血清レチノールの割合を比較することを目指しています. 研究者はまた、血清レチノールの感度 (バイオマーカーが欠乏している人を正しく識別する能力) と特異性 (バイオマーカーが欠乏していない人を正しく識別する能力) を評価して、ビタミン A 欠乏症、肺葉間の肝臓ビタミン A 濃度の変動を判断します。 、肝臓のアルファレチニルエステル濃度、ビタミンA前駆体であるアルファカロチンの切断産物。

この研究を実施するために、対応する血清と肝臓のサンプルを 27 人の米国成人死体 (49 ～ 101 歳のドナーから) から入手し、それらのビタミン A バイオマーカーを分析しました。 対応するヒトの肝臓と血清のサンプルは、27 体の死体 (男性 13 体、女性 14 体) から収集され、National Disease Research Interchange サービスへの要求を通じて連続サンプルとして取得されました。 匿名化された病歴要約も取得されました。 ドナーの基準は次のとおりです: 人種または性別の制限がないこと、化学療法および/または放射線療法の履歴がないこと、長期の気管内挿管または換気の履歴がないこと、敗血症または感染症の証拠がないこと (陰性血清学パネル)、および年齢範囲が 21 歳であること-54 歳、55 ～ 74 歳、および 75 歳以上 (不均一なサンプルを提供するために、ターゲット コレクションは、年齢範囲ごとに男性 5 名と女性 5 名のドナーでした)。 各年齢層 (55 ～ 74 歳および 75 歳以上) で 10 人が取得された後、サンプルは要求されなくなりました。 すべての組織と血清は、2013 年 9 月から 2016 年 8 月までの死後 16 時間以内に調達されました。 調達プロトコル番号は、凍結肝臓、包埋肝臓、および血清について、それぞれ DWEN1 002 022、002 023、および 002 024 でした。 血清サンプルは、ゲル分離によって分離され、その後凍結されました。一次肝臓サンプルは液体窒素で急速凍結しました。各ドナーからの 2 番目の肝臓サンプルは、最適切断温度化合物 (OCT) に埋め込まれ、凍結金型でスナップ凍結されました。 2 つの肝臓は、ほぼ全体を調達し、葉内および葉の間の VA 分布を評価しました。 サンプルはドライアイスでウィスコンシン州マディソンに発送され、-80°C の冷凍庫に保管されました。

OCT 包埋肝臓サンプルは、クライオスタットを使用して 5 μm の凍結切片として調製し、通常のヘマトキシリンとエオシン、およびマッソンのトリクローム プロトコルと試薬 (Newcomer Supply、ウィスコンシン州ミドルトン) を使用して染色しました。 Nikon E-600 明視野顕微鏡 (Melville, NY) および Olympus DP-71 デジタル顕微鏡カメラ (Center Valley, PA) を使用して画像を取得しました。 VA およびカロテノイド分析用の肝臓サンプル (1 g) を秤量し、その後、公開されている方法を少し変更して、乳鉢と乳棒で硫酸ナトリウム (4 ～ 5 g) で粉砕しました。 精製 C-23 β-アポ-カロテノールを加えて、抽出効率を測定しました。 サンプルをジクロロメタンで繰り返し抽出し、WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) を通して 50 mL メスフラスコにろ過しました。 アリコート (5 mL) を窒素下で乾燥させ、300 μL のメタノール:ジクロロエタン (75:25、体積: 体積) に再溶解し、1 μL のアリコートを Waters Acquity H-Class 超高圧液体クロマトグラフ (フォトダイオード アレイ検出器を備えた UPLC®) システム (マサチューセッツ州ミルフォード)。 葉の分析について以下に記載するように、総α-レチノールの定量化のためにアリコートをさらにケン化した。 肝葉のサンプル評価では、利用可能な各葉から 1 g のサンプルを 3 回抽出しました。 抽出物の 5 mL アリコートを 400 mL の水酸化カリウム:水 (50:50、重量:容量) で 45°C で 1 時間けん化しました。 反応を０．５ｍＬの水でクエンチし、０．５ｍＬのヘキサンで３回抽出した。 ヘキサン層をプールし、窒素下で乾燥させ、150 µL のメタノール:ジクロロエタン (75:25、容積:容積) に再溶解し、1 µL のアリコートを UPLC® システムに注入しました。

レチノールと RE の測定のために、血清サンプル (0.5 mL) を試験管に分注しました。 1.25 X 容量のエタノールを添加して、タンパク質を変性させました。 内部標準は、C23-β-アポ-カロテノールでした。 サンプルを 0.75 mL のヘキサンで 3 回抽出しました。上清画分をプールし、窒素下で乾燥させ、100 μL のメタノール: ジクロロエタン (75:25、体積:体積) で再構成しました。 以下の条件で、2 µL を UPLC® に注入しました。 血清 C 反応性タンパク質 (CRP) とアルファ 1 酸性糖タンパク質 (AGP) を分析して、ELISA キット (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam) を使用して炎症を評価しました。 リコピン、アルファおよびベータカロテンの濃度は、ルーチンの HPLC 分析によって決定されました。

超高速液体クロマトグラフ (UPLC) メソッド Waters Acquity UPLC HSS C18 1.8 µm VanGuard プレカラムを、Waters Acquity UPLC® HSS C18 カラム (1.8 µm、2.1 x 150 mm) と組み合わせて使用​​しました。 メソッドは、29 分のグラジエント用にプログラムされた 2 つの溶媒混合物を利用しました。 溶媒 A は 10 mmol/L 酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル-水-イソプロパノール (70:25:5、体積:体積:体積) であり、溶媒 B はメタノール-イソプロパノール (75:25、体積:体積) でした。 カラム温度は 32°C に設定し、流速は 0.4 mL/min でした。 グラジエントは、100% 溶媒 A を 7 分間保持することから始まり、その後 4 分間で 5% A に直線的に移行し、さらに 12 分かけて 1% A に移行しました。 次に、溶媒勾配を 2 分で 100% A に戻し、4 分間平衡化しました。 クロマトグラムは、α-レチノールおよびα-REについては311 nm、レチノールおよびREについては325 nm、カロテノイドについては450 nmで生成されました。 食事中のベータカロチンにほぼ独占的に由来するアルファ-REは、野菜の長期暴露の代用として定量化されました. 濃度は、α-レチノールおよびレチノールの本物のHPLC精製標準から得られた標準曲線を使用して計算されました。