颗粒酶和穿孔素在慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 恶化发作时的作用

慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 的病程以恶化为特征，这会导致显着的临床恶化和发病。COPD 恶化的特点是在稳定状态下在气道中观察到的炎症加重，特别是多形核中性粒细胞的过度积累和淋巴细胞的活化。

有人提出，COPD 患者在恶化期间气道中炎症细胞的异常增加可能代表气道中通过将颗粒内容物释放到细胞外环境中而导致过度蛋白水解活性的重大风险。 包括 NK 细胞和细胞毒性 T 细胞的大颗粒淋巴细胞 (LGL) 和中性粒细胞含有细胞溶解分子，例如颗粒酶和穿孔素。 因此，恶化期间的炎症过程可能对肺有潜在的毒性。 值得注意的是，研究表明，与正常受试者相比，稳定期 COPD 患者的痰液 T 淋巴细胞 (CD8+) 表达更多的穿孔素并且具有更强的细胞毒性。

然而，之前很少有研究质疑这些细胞溶解分子在 COPD 病理生理学中的作用。 此外，尽管在理解 COPD 的潜在机制方面取得了相当大的进展，但还没有研究调查 COPD 恶化期间穿孔素或颗粒酶的表达。

在目前的前瞻性研究中，我们使用流式细胞术评估了 COPD 患者痰液发作时中性粒细胞和 LGL 细胞中颗粒酶和穿孔素的细胞内表达。

主题和协议：

COPD 受试者将在恶化开始时和病情稳定时接受检查。 恶化的定义将基于 Anthonisen 描述的标准，要求存在至少两种主要症状（呼吸困难增加、咳痰、化脓）或一种主要症状加上至少一种轻微症状（喘息、连续两天咳嗽、流鼻涕、喉咙痛、发烧）。

此外，我们将评估颗粒酶和穿孔素在非 COPD 受试者（对照组）的中性粒细胞和 LGL 细胞中的表达，这些受试者将通过在研究期间在诊所寻求医疗帮助的受试者中连续抽样招募，并且他们满足以下所有条件标准：i) 没有慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、肺癌、支气管扩张、间质性肺病或其他呼吸系统疾病的证据 ii) 在过去 72 小时内开始诊断为呼吸道感染的症状，iii) 放弃任何新的治疗干预， iv) 没有任何迹象表明需要住院治疗。 对照受试者将在呼吸道感染开始时和病情稳定时接受检查。 呼吸道感染的定义需要连续两天出现以下症状之一，例如呼吸困难、咳痰、化脓、咳嗽、±发热。 对照的稳定状态将被定义为没有呼吸道感染/基于症状的恶化。

本研究经医院研究伦理委员会批准。 痰诱导和处理 分别在同一患者和对照受试者的恶化或呼吸道感染和稳定状态（恶化后至少 8 周）中诱导痰；样品将被处理用于分析炎症细胞和细胞因子以及微生物学。 将通过吸入高渗盐水溶液气雾剂（Ultraneb 2000；DeVilbiss；萨默塞特，宾夕法尼亚州）诱发痰液。

抗体标记：

以下小鼠抗人单克隆抗体将用于标记痰细胞：藻红蛋白偶联的抗 CD3 (PE-CD3)、藻红蛋白 5 偶联的 (antiCD4-PCy5)、异硫氰酸荧光素偶联的抗穿孔素抗体、(antiperforin- FITC) 和异硫氰酸荧光素偶联物也将用于细胞内穿孔素和颗粒酶的竞争性检测。 “a intraprep kit”（Beckman-Coulter Inc Fullerton Ca, USA）。 同种型抗体小鼠抗小鼠 IgG 将用作对照（Immunotech；法国马赛）。 为了标记细胞表面抗原，悬浮的 1x106 细胞将与正常牛血清一起孵育以阻断非特异性结合（阻断剂），然后加入过量的单克隆抗体（根据制造商的说明）在 10° 下 45 分钟C 在黑暗中，用 PBS 加 10% FCS 洗涤 3 次。 对于细胞内穿孔素和颗粒酶染色，随后将细胞在透化试剂（Intraprep；Beckman Coulter；Fullerton，CA）中孵育 10 分钟。 作为对照，透化后将使用摩尔过量的未标记的抗穿孔素（或抗颗粒酶），然后添加抗穿孔素（或抗颗粒酶）FITC，无需洗涤，并在室温下孵育 30 分钟（竞争性标记）。 染色后，样品将用 PBS 加 10% FCS 洗涤，并立即使用流式细胞术进行分析。

流式细胞仪分析：

如上所述制备的痰液样本将在荧光激活细胞仪（EPICS ELITE；Coultronics；Louton，UK）上进行分析。 在前向 (0o) 和侧光散射 (90o) 模式下，细胞将根据体积和复杂性进行严格门控。 每个会话至少分析 105 个细胞。 PCy-5 缀合的抗人 CD45 单克隆抗体（Dako；Ely，UK）将用作泛白细胞染色剂，以通过逻辑门控排除非白细胞事件。 将测量单色、双色和三色阳性细胞的百分比，并估计平均通道值以及与抗原密度对应的相对荧光强度 (RFI)。 QC-Combo 试剂盒（FCSC；San Jun，波多黎各）将用于抗体结合的量化，日常仪器校准（流式细胞仪的放大和补偿设置）将定期进行。 将根据前向和侧向散射以及 CD45 表达进行门控。 中性粒细胞和淋巴细胞群中的阳性细胞将测量为每个细胞群的百分比。

按照上述方法，我们将评估加重期和稳定期 COPD 中嗜中性粒细胞和 LGL 细胞中穿孔素的表达以及嗜中性粒细胞和 LGL 细胞中颗粒酶的表达。