Granzymer och perforin vid uppkomsten av kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) exacerbationer

Förloppet av kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) kännetecknas av exacerbationer som leder till signifikant klinisk försämring och sjuklighet. KOL-exacerbationer kännetecknas av en förstärkning av den inflammation som observeras i luftvägarna i stabilt tillstånd, särskilt av överdriven ackumulering av polymorfonukleära neutrofiler och aktivering av lymfocyter.

Det har föreslagits att denna onormala ökning av inflammatoriska celler i luftvägarna hos KOL-patienter under exacerbationer kan representera en betydande risk för överdriven proteolytisk aktivitet i luftvägarna via frisättning av deras granulinnehåll till den extracellulära miljön. Stora granulära lymfocyter (LGL) som inkluderar NK och cytotoxiska T-celler och neutrofiler innehåller cytolytiska molekyler som granzymer och perforin. Därför kan den inflammatoriska processen under exacerbationer vara potentiellt giftig för lungan. Noterbart visades att sputum T-lymfocyter (CD8+) från patienter med stabil KOL uttrycker mer perforin och är mer cytotoxiska jämfört med normala försökspersoner.

Men få tidigare undersökningar ifrågasatte rollen av dessa cytolytiska molekyler i patofysiologin för KOL. Dessutom, trots de avsevärda framsteg som har gjorts för att förstå de underliggande mekanismerna i KOL, har det inte gjorts några studier som undersökt uttrycket av perforin eller granzymer under KOL-exacerbationer.

I den nuvarande prospektiva undersökningen bedömer vi det intracellulära uttrycket av granzymer och perforin i neutrofiler och LGL-celler vid uppkomsten av sputum hos KOL-patienter genom att använda flödescytometri.

Ämnen och protokoll:

KOL-personer kommer att undersökas i början av en exacerbation och i stabilt tillstånd. Definitionen av en exacerbation kommer att baseras på de kriterier som beskrivits av Anthonisen, som kräver antingen närvaro av minst två huvudsymptom (ökad dyspné, sputumproduktion, purulens) eller av ett stort symptom utöver minst ett mindre (väsande andning, hosta, flytningar från näsan, ont i halsen, feber), i två på varandra följande dagar.

Dessutom kommer vi att bedöma uttrycket av granzymer och perforin i neutrofiler och LGL-celler från försökspersoner utan KOL (kontroller) som kommer att rekryteras genom konsekutiv provtagning bland de försökspersoner som söker medicinsk hjälp på kliniken under studieperioden och de uppfyller alla följande kriterier: i) frånvaro av KOL, astma, lunginflammation, tecken på lungcancer, bronkiektasis, interstitiell lungsjukdom eller annan luftvägssjukdom ii) initiering av symtom som är diagnostiska för luftvägsinfektion under de senaste 72 timmarna, iii) avstå från ny terapeutisk intervention, och iv) frånvaro av några tecken som tyder på tillstånd som kräver sjukhusvistelse. Kontrollpersoner kommer att undersökas vid uppkomsten av luftvägsinfektioner och vid stabilt tillstånd. Definitionen av en luftvägsinfektion kräver närvaro av ett av följande symtom såsom dyspné, sputumproduktion, purulens, hosta, ± feber, under två på varandra följande dagar. Stabilt tillstånd för kontroller kommer att definieras som frånvaro av luftvägsinfektion/exacerbation baserat på symtom.

Studien är godkänd av Sjukhusets forskningsetiska kommitté. Sputuminduktion och bearbetning Sputum kommer att induceras vid exacerbation eller luftvägsinfektion och i stabilt tillstånd (minst 8 veckor efter exacerbation) av samma patient respektive kontrollperson; prover kommer att bearbetas för analys av inflammatoriska celler och cytokiner och mikrobiologi. Sputum kommer att induceras via inandning av en hypertonisk saltlösningsaerosol (Ultraneb 2000; DeVilbiss; Somerset, PA).

Antikroppsmärkning:

Följande anti-humana monoklonala musantikroppar kommer att användas för att märka sputumceller: fykoerytrin-konjugerad antiCD3 (PE-CD3), fykoerytrin-5-konjugerad (antiCD4-PCy5), fluoresceinisotiocyanat-konjugerad anti-perforin-forin-antikropp, (antiperforin-forin-antikropp, FITC) och fluorescein isotiocyanat-konjugat kommer också att användas för konkurrerande detektion av intracellulärt perforin och granzymer. "A intraprep kit" (Beckman-Coulter Inc Fullerton Ca, USA). Isotypande antikroppar mus-antimus-IgG kommer att användas som kontroller (Immunotech; Marseille, Frankrike). För märkning av cellyteantigener kommer 1x106 celler i suspension att inkuberas med normalt bovint serum för att blockera den ospecifika bindningen (blockerande reagens), och sedan tillsätts den monoklonala antikroppen/antikropparna i överskott (enligt tillverkarens instruktioner) i 45 minuter vid 10° C i mörker och tvättas tre gånger med PBS plus 10 % FCS. För intracellulär färgning av perforin och granzymer kommer cellerna att inkuberas i ett permeabiliseringsreagens (Intraprep; Beckman Coulter; Fullerton, CA) i 10 minuter. Som kontroll kommer omärkt antiperforin (eller antigranzym) i molärt överskott att användas efter permeabilisering och sedan kommer antiperforin (eller antigranzym) FITC att tillsättas utan tvätt och inkuberas i 30 minuter vid rumstemperatur (konkurrensmärkning). Efter färgning kommer proverna att tvättas med PBS plus 10 % FCS och analyseras omedelbart med flödescytometri.

Flödescytometrisk analys:

Sputumproverna framställda enligt beskrivningen ovan kommer att analyseras på en fluorescensaktiverad cytometer (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, Storbritannien). Celler kommer att vara tätt gated av volym och komplexitet på ett framåt (0o) och sidoljusspridning (90o) läge. Minst 105 celler analyserades i varje session. PCy-5-konjugerade anti-humana CD45 monoklonala antikroppar (Dako; Ely, Storbritannien) kommer att användas som pan-leukocytfärgning för att utesluta icke-leukocythändelser genom logisk gating. Procentandelen av enfärgade, tvåfärgade och trefärgade positiva celler kommer att mätas och medelkanalvärdet samt den relativa fluorescensintensiteten (RFI) som motsvarar antigendensiteten kommer att uppskattas. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) kommer att användas för kvantifiering av antikroppsbindning och daglig instrumentkalibrering (förstärknings- och kompensationsinställningar för flödescytometern) kommer att utföras rutinmässigt. Gating kommer att utföras enligt framåt- och sidospridning och CD45-uttryck. Positiva celler inom den neutrofila och lymfocytiska populationen kommer att mätas i procent av varje cellpopulation.

Enligt ovanstående metod kommer vi att bedöma uttrycket av perforin i neutrofiler och LGL-celler och uttrycket av granzymer i neutrofiler och LGL-celler både vid exacerbation och vid stabil KOL.