Granzimek és perforin a krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD) súlyosbodásának kezdetén

A krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD) lefolyását exacerbációk jellemzik, amelyek jelentős klinikai állapotromláshoz és morbiditáshoz vezetnek. A COPD exacerbációit a légutakban megfigyelhető gyulladás fokozódása jellemzi stabil állapotban, különösen a polimorfonukleáris neutrofilek túlzott felhalmozódása miatt. és a limfociták aktiválása.

Feltételezték, hogy a gyulladásos sejtek számának ez a kóros növekedése a COPD-s betegek légútjaiban az exacerbációk során jelentős kockázatot jelenthet a túlzott proteolitikus aktivitásra a légutakban azáltal, hogy granulátumtartalmuk az extracelluláris környezetbe kerül. A nagy szemcsés limfociták (LGL), amelyek magukban foglalják az NK-t és a citotoxikus T-sejteket és a neutrofileket, citolitikus molekulákat, például granzimeket és perforint tartalmaznak. Ezért az exacerbációk során fellépő gyulladásos folyamat potenciálisan mérgező lehet a tüdőre nézve. Nevezetesen kimutatták, hogy a stabil COPD-ben szenvedő betegek köpet T-limfocitái (CD8+) több perforint expresszálnak és citotoxikusabbak a normál alanyokhoz képest.

Azonban néhány korábbi vizsgálat megkérdőjelezte e citolitikus molekulák szerepét a COPD patofiziológiájában. Ezen túlmenően, annak ellenére, hogy jelentős előrelépés történt a COPD mögöttes mechanizmusok megértésében, nem készültek olyan tanulmányok, amelyek a perforin vagy a granzimek expresszióját vizsgálták volna a COPD exacerbációja során.

Jelen prospektív vizsgálatunkban a granzimek és a perforin intracelluláris expresszióját mérjük neutrofilekben és LGL sejtekben COPD-s betegek köpet megjelenésekor áramlási citometriával.

Tantárgyak és protokoll:

A COPD-s alanyokat az exacerbáció kezdetekor és stabil állapotban vizsgálják meg. Az exacerbáció meghatározása az Anthonisen által leírt kritériumokon fog alapulni, amelyek legalább két fő tünet (diszpnea, köpettermelés, gennyesedés) vagy legalább egy kisebb tünet mellett egy fő tünet (zihálás, zihálás köhögés, orrfolyás, torokfájás, láz), két egymást követő napon.

Ezenkívül értékelni fogjuk a granzimek és a perforin expresszióját COPD-ben nem szenvedő alanyok neutrofiljeiben és LGL sejtjeiben, akiket egymást követő mintavétellel vesznek fel azon alanyok közül, akik a klinikán a vizsgálati időszak alatt orvosi segítséget kérnek, és megfelelnek az alábbi követelményeknek. kritériumok: i) COPD, asztma, tüdőgyulladás, tüdőrák, bronchiectasia, intersticiális tüdőbetegség vagy egyéb légúti betegség bizonyítéka hiánya ii) légúti fertőzésre diagnosztikus tünetek megjelenése az elmúlt 72 órában, iii) tartózkodás minden új terápiás beavatkozástól, és iv. a kórházi kezelést igénylő állapotra utaló jelek hiánya. A kontroll alanyokat a légúti fertőzések kezdetekor és stabil állapotukban vizsgálják meg. A légúti fertőzés definíciója megköveteli az alábbi tünetek egyikének jelenlétét, például nehézlégzés, köpettermelés, gennyesedés, köhögés, ± láz, két egymást követő napon. A kontrollok stabil állapotát a tünetek alapján a légúti fertőzés/exacerbáció hiányaként határozzuk meg.

A vizsgálatot a Kórház Kutatásetikai Bizottsága hagyta jóvá. Köpet indukciója és feldolgozása Ugyanannál a betegnél és a kontroll alanynál a köpet indukálódik exacerbáció vagy légúti fertőzés esetén és stabil állapotban (legalább 8 héttel az exacerbáció után); A mintákat feldolgozzák a gyulladásos sejtek és citokinek elemzéséhez, valamint a mikrobiológiához. A köpetet hipertóniás sóoldat-aeroszol (Ultraneb 2000; DeVilbiss; Somerset, PA) belélegzésével indukálják.

Antitest jelölés:

A köpetsejtek jelölésére a következő egér anti-humán monoklonális antitesteket fogják használni: fikoeritrin-konjugált antiCD3 (PE-CD3), fikoeritrin-5-konjugált (antiCD4-PCy5), fluoreszcein-izotiocianát-konjugált anti-perforin-antitest, (anti-perforin-antitest, FITC) és fluoreszcein-izotiocianát-konjugátum is használható lesz az intracelluláris perforin és a granzimek kompetitív kimutatására. Az "egy intraprep kit" (Beckman-Coulter Inc. Fullerton Ca, USA). Az izotipizáló antitestek egér antiegér IgG-t használnak kontrollként (Immunotech; Marseille, Franciaország). A sejtfelszíni antigének jelöléséhez 1x106 szuszpenzióban lévő sejtet normál szarvasmarha szérummal inkubálunk a nem specifikus kötődés blokkolására (blokkoló reagens), majd a monoklonális antitestet/antitesteket feleslegben adjuk hozzá (a gyártó utasítása szerint) 45 percig 10°-on. C-on sötétben, és háromszor mossuk PBS plusz 10% FCS-sel. Az intracelluláris perforin és granzim festéshez a sejteket ezt követően permeabilizáló reagensben (Intraprep; Beckman Coulter; Fullerton, CA) 10 percig inkubáljuk. Kontrollként moláris feleslegben lévő jelöletlen antiperforint (vagy antigranzimet) használnak fel permeabilizálás után, majd antiperforint (vagy antigranzim) FITC-t adnak hozzá mosás nélkül, és 30 percig szobahőmérsékleten inkubálják (versenyképes jelölés). A festés után a mintákat PBS plusz 10% FCS-sel mossuk, és áramlási citometriával azonnal elemzik.

Áramlási citometrikus elemzés:

A fent leírt módon elkészített köpetmintákat fluoreszcenciával aktivált citométeren (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK) elemzik. A cellák térfogata és összetettsége szorosan zárva lesz előre (0o) és oldalsó fényszórás (90o) módban. Minden munkamenetben legalább 105 sejtet elemeztünk. PCy-5-konjugált anti-humán CD45 monoklonális antitesteket (Dako; Ely, UK) használunk pán-leukocita festésként a nem leukocita események kizárására logikai kapuzással. Megmérik az egyszínű, kétszínű és háromszínű pozitív sejtek százalékos arányát, és megbecsülik az átlagos csatornaértéket, valamint az antigénsűrűségnek megfelelő relatív fluoreszcencia intenzitást (RFI). A QC-Combo Kit-et (FCSC; San Jun, Puerto Rico) használják az antitestek kötődésének számszerűsítésére, és rutinszerűen elvégzik a napi műszerkalibrációt (az áramlási citométer amplifikációs és kompenzációs beállításait). A kapuzás az előre és oldalsó szórás és a CD45 expresszió szerint történik. A neutrofil és limfocita populáción belüli pozitív sejteket az egyes sejtpopulációk százalékában mérjük.

A fenti módszert követve értékeljük a perforin expresszióját neutrofilekben és LGL sejtekben, valamint a granzimek expresszióját neutrofilekben és LGL sejtekben mind exacerbációban, mind stabil COPD-ben.