Granzymes und Perforin beim Einsetzen von Exazerbationen der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD).

Der Verlauf der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) ist durch Exazerbationen gekennzeichnet, die zu einer signifikanten klinischen Verschlechterung und Morbidität führen. COPD-Exazerbationen sind gekennzeichnet durch eine Zunahme der Entzündung, die in den Atemwegen bei stabilem Zustand beobachtet wird, insbesondere durch eine übermäßige Ansammlung von polymorphkernigen Neutrophilen und Aktivierung von Lymphozyten.

Es wurde vermutet, dass diese abnormale Zunahme von Entzündungszellen in den Atemwegen von COPD-Patienten während Exazerbationen ein erhebliches Risiko für eine übermäßige proteolytische Aktivität in den Atemwegen darstellen könnte, da deren Granula-Inhalt in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt wird. Große granuläre Lymphozyten (LGL), die NK und zytotoxische T-Zellen umfassen, und Neutrophile enthalten zytolytische Moleküle wie Granzyme und Perforin. Daher könnte der Entzündungsprozess während Exazerbationen möglicherweise toxisch für die Lunge sein. Insbesondere wurde gezeigt, dass Sputum-T-Lymphozyten (CD8+) von Patienten mit stabiler COPD mehr Perforin exprimieren und im Vergleich zu gesunden Probanden zytotoxischer sind.

Allerdings haben nur wenige frühere Untersuchungen die Rolle dieser zytolytischen Moleküle in der Pathophysiologie von COPD in Frage gestellt. Darüber hinaus gab es trotz der beträchtlichen Fortschritte, die beim Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen bei COPD gemacht wurden, keine Studien, die die Expression von Perforin oder Granzymen während COPD-Exazerbationen untersuchten.

In der vorliegenden prospektiven Untersuchung untersuchen wir die intrazelluläre Expression von Granzymen und Perforin in Neutrophilen und LGL-Zellen zu Beginn des Sputums von COPD-Patienten mittels Durchflusszytometrie.

Fächer und Protokoll:

COPD-Patienten werden zu Beginn einer Exazerbation und in stabilem Zustand untersucht. Die Definition einer Exazerbation basiert auf den von Anthonisen beschriebenen Kriterien, die entweder das Vorhandensein von mindestens zwei Hauptsymptomen (Erhöhung von Dyspnoe, Auswurf, Eiter) oder eines Hauptsymptoms zusätzlich zu mindestens einem Nebensymptom (keuchen, Husten, Nasenausfluss, Halsschmerzen, Fieber) an zwei aufeinanderfolgenden Tagen.

Darüber hinaus werden wir die Expression von Granzymen und Perforin in Neutrophilen und LGL-Zellen von Probanden ohne COPD (Kontrollen) bewerten, die durch aufeinanderfolgende Stichproben unter den Probanden rekrutiert werden, die während des Studienzeitraums medizinische Hilfe in der Klinik suchen und alle folgenden Bedingungen erfüllen Kriterien: i) Fehlen von COPD, Asthma, Pneumonie, Anzeichen von Lungenkrebs, Bronchiektasie, interstitieller Lungenerkrankung oder einer anderen Atemwegserkrankung, ii) Auftreten von Symptomen, die für eine Atemwegsinfektion diagnostisch sind, in den letzten 72 Stunden, iii) Verzicht auf jegliche neue therapeutische Intervention, und iv) Fehlen jeglicher Anzeichen, die auf einen Zustand hindeuten, der einen Krankenhausaufenthalt erfordert. Kontrollpersonen werden beim Einsetzen von Atemwegsinfektionen und bei stabilem Zustand untersucht. Die Definition einer Atemwegsinfektion erfordert das Vorhandensein eines der folgenden Symptome wie Dyspnoe, Auswurf, Eiter, Husten, ± Fieber an zwei aufeinanderfolgenden Tagen. Stabiler Zustand für Kontrollen wird definiert als Abwesenheit einer Atemwegsinfektion/-exazerbation basierend auf Symptomen.

Die Studie wurde von der Forschungsethikkommission des Krankenhauses genehmigt. Sputuminduktion und -verarbeitung Sputum wird bei Exazerbation oder Atemwegsinfektion und in stabilem Zustand (mindestens 8 Wochen nach Exazerbation) desselben Patienten bzw. Kontrollsubjekts induziert; Proben werden für die Analyse von Entzündungszellen und Zytokinen und Mikrobiologie verarbeitet. Sputum wird durch Inhalation eines hypertonischen Kochsalzlösungsaerosols (Ultraneb 2000; DeVilbiss; Somerset, PA) induziert.

Antikörperkennzeichnung:

Die folgenden monoklonalen Anti-Human-Maus-Antikörper werden zur Markierung von Sputumzellen verwendet: Phycoerythrin-konjugierter Anti-CD3 (PE-CD3), Phycoerythrin-5-konjugierter (Anti-CD4-PCy5), Fluorescein-Isothiocyanat-konjugierter Anti-Perforin-Antikörper, (Antiperforin- FITC) und Fluorescein-Isothiocyanat-Konjugat werden auch für den kompetitiven Nachweis von intrazellulärem Perforin und Granzymen verwendet. Das "a intraprep kit" (Beckman-Coulter Inc Fullerton Ca, USA). Isotypisierende Antikörper Maus-Anti-Maus-IgG werden als Kontrollen verwendet (Immunotech; Marseille, Frankreich). Zur Markierung von Zelloberflächenantigenen werden 1x106 Zellen in Suspension mit normalem Rinderserum zur Blockierung der unspezifischen Bindung (Blockierungsreagenz) inkubiert und anschließend der/die monoklonalen Antikörper/Antikörper im Überschuss (nach Herstellerangaben) für 45 min bei 10° zugegeben C im Dunkeln gewaschen und dreimal mit PBS plus 10 % FCS gewaschen. Für die intrazelluläre Perforin- und Granzym-Färbung werden die Zellen anschließend in einem Permeabilisierungsreagenz (Intraprep; Beckman Coulter; Fullerton, CA) für 10 min inkubiert. Als Kontrolle wird unmarkiertes Antiperforin (oder Antigranzym) in molarem Überschuss nach der Permeabilisierung verwendet und dann wird Antiperforin (oder Antigranzym) FITC ohne Waschen zugegeben und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert (kompetitive Markierung). Nach dem Färben werden die Proben mit PBS plus 10 % FCS gewaschen und sofort mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Durchflusszytometrische Analyse:

Die wie oben beschrieben hergestellten Sputumproben werden auf einem fluoreszenzaktivierten Zytometer (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK) analysiert. Die Zellen werden nach Volumen und Komplexität in einem Vorwärts- (0o) und Seitenlichtstreumodus (90o) streng abgegrenzt. Mindestens 105 Zellen wurden in jeder Sitzung analysiert. PCy-5-konjugierte monoklonale Anti-Human-CD45-Antikörper (Dako; Ely, UK) werden als Pan-Leukozyten-Färbung verwendet, um Nicht-Leukozyten-Ereignisse durch logisches Gating auszuschließen. Der Prozentsatz einfarbiger, zweifarbiger und dreifarbiger positiver Zellen wird gemessen und der mittlere Kanalwert sowie die der Antigendichte entsprechende relative Fluoreszenzintensität (RFI) geschätzt. Das QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) wird zur Quantifizierung der Antikörperbindung verwendet und die tägliche Instrumentenkalibrierung (Amplifikations- und Kompensationseinstellungen des Durchflusszytometers) wird routinemäßig durchgeführt. Das Gating wird gemäß Vorwärts- und Seitenstreuung und CD45-Expression durchgeführt. Positive Zellen innerhalb der neutrophilen und lymphozytären Population werden als Prozentsätze jeder Zellpopulation gemessen.

Gemäß der obigen Methodik werden wir die Expression von Perforin in Neutrophilen und LGL-Zellen und die Expression von Granzymen in Neutrophilen und LGL-Zellen sowohl bei Exazerbation als auch bei stabiler COPD bewerten.