Гранзимы и перфорин в дебюте обострений хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ)

Течение хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) характеризуется обострениями, которые приводят к значительному клиническому ухудшению и заболеваемости. и активация лимфоцитов.

Было высказано предположение, что это аномальное увеличение воспалительных клеток в дыхательных путях пациентов с ХОБЛ во время обострений может представлять значительный риск чрезмерной протеолитической активности в дыхательных путях за счет высвобождения содержимого их гранул во внеклеточную среду. Крупные гранулярные лимфоциты (LGL), которые включают NK и цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, содержат цитолитические молекулы, такие как гранзимы и перфорин. Следовательно, воспалительный процесс во время обострений может быть потенциально токсичным для легких. Примечательно, что было показано, что Т-лимфоциты мокроты (CD8+) пациентов со стабильной ХОБЛ экспрессируют больше перфорина и более цитотоксичны по сравнению со здоровыми субъектами.

Однако несколько предыдущих исследований поставили под сомнение роль этих цитолитических молекул в патофизиологии ХОБЛ. Более того, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании механизмов, лежащих в основе ХОБЛ, исследований по изучению экспрессии перфорина или гранзимов при обострении ХОБЛ не проводилось.

В настоящем проспективном исследовании мы оцениваем внутриклеточную экспрессию гранзимов и перфорина в нейтрофилах и клетках LGL в начале выделения мокроты у пациентов с ХОБЛ с помощью проточной цитометрии.

Субъекты и протокол:

Субъекты ХОБЛ будут обследованы в начале обострения и в стабильном состоянии. Определение обострения будет основываться на критериях, описанных Антонисеном, требующих либо наличия по крайней мере двух основных симптомов (усиление одышки, выделение мокроты, гной), либо одного основного симптома в дополнение по крайней мере к одному второстепенному (хрипы, кашель, выделения из носа, боль в горле, лихорадка) в течение двух дней подряд.

Кроме того, мы будем оценивать экспрессию гранзимов и перфорина в нейтрофилах и клетках LGL субъектов без ХОБЛ (контроль), которые будут набраны путем последовательного отбора проб среди тех субъектов, которые обращаются за медицинской помощью в клинику в течение периода исследования, и они удовлетворяют всем следующим критерии: i) отсутствие ХОБЛ, астмы, пневмонии, признаков рака легких, бронхоэктазов, интерстициального заболевания легких или другого респираторного заболевания ii) появление симптомов, диагностических для респираторной инфекции, в течение последних 72 часов, iii) воздержание от любого нового терапевтического вмешательства, и iv) отсутствие каких-либо признаков состояния, требующего госпитализации. Контрольные субъекты будут обследованы в начале респираторных инфекций и при стабильном состоянии. Для определения респираторной инфекции требуется наличие одного из следующих симптомов, таких как одышка, выделение мокроты, гной, кашель, ± лихорадка, в течение двух дней подряд. Стабильное состояние для контроля будет определяться как отсутствие респираторной инфекции/обострения на основании симптомов.

Исследование одобрено Комитетом по этике исследований больницы. Индукция и обработка мокроты. Мокрота будет индуцироваться при обострении или респираторной инфекции и в стабильном состоянии (по крайней мере, через 8 недель после обострения) у одного и того же пациента и контрольного субъекта соответственно; образцы будут обработаны для анализа воспалительных клеток и цитокинов и микробиологии. Мокроту индуцируют путем вдыхания аэрозоля гипертонического солевого раствора (Ultraneb 2000; DeVilbiss; Somerset, PA).

Маркировка антител:

Следующие мышиные моноклональные антитела против человека будут использоваться для мечения клеток мокроты: анти-CD3, конъюгированные с фикоэритрином (PE-CD3), конъюгированные с фикоэритрином-5 (анти-CD4-PCy5), антитела против перфорина, конъюгированные с изотиоцианатом флуоресцеина, (антиперфорин- FITC) и конъюгат изотиоцианата флуоресцеина также будут использоваться для конкурентного обнаружения внутриклеточных перфоринов и гранзимов. Интрапреп-набор (Beckman-Coulter Inc Fullerton Ca, США). Изотипирование антител мыши против мышиного IgG будет использоваться в качестве контроля (Immunotech; Марсель, Франция). Для мечения антигенов клеточной поверхности суспензию 1x106 клеток инкубируют с нормальной бычьей сывороткой для блокирования неспецифического связывания (блокирующий реагент), а затем добавляют моноклональное антитело/антитела в избытке (согласно инструкции производителя) в течение 45 мин при 10°С. C в темноте и трижды промывали PBS плюс 10% FCS. Для внутриклеточного окрашивания перфорином и гранзимами клетки впоследствии инкубируют в пермеабилизирующем реагенте (Intraprep; Beckman Coulter; Fullerton, CA) в течение 10 мин. В качестве контроля после пермеабилизации будет использоваться немеченый антиперфорин (или антигранзим) в молярном избытке, а затем будет добавлен антиперфорин (или антигранзим) FITC без промывки и инкубирован в течение 30 минут при комнатной температуре (конкурентное мечение). После окрашивания образцы промывают PBS плюс 10% FCS и сразу же анализируют с помощью проточной цитометрии.

Проточный цитометрический анализ:

Образцы мокроты, приготовленные, как описано выше, будут проанализированы на флуоресцентном цитометре (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Ячейки будут плотно закрыты по объему и сложности в режиме прямого (0°) и бокового светорассеяния (90°). В каждом сеансе анализировали не менее 105 клеток. Моноклональные антитела против человеческого CD45, конъюгированные с PCy-5 (Dako; Ely, Великобритания), будут использоваться в качестве пан-лейкоцитарного окрашивания для исключения нелейкоцитарных явлений путем логического гейтирования. Будет измерен процент одноцветных, двухцветных и трехцветных положительных клеток, и будет оценено среднее значение канала, а также относительная интенсивность флуоресценции (RFI), соответствующая плотности антигена. Набор QC-Combo Kit (FCSC; Сан-Джун, Пуэрто-Рико) будет использоваться для количественной оценки связывания антител, и будет регулярно выполняться повседневная калибровка прибора (настройки амплификации и компенсации проточного цитометра). Гейтирование будет осуществляться в соответствии с прямым и боковым рассеянием и экспрессией CD45. Положительные клетки в нейтрофильной и лимфоцитарной популяции будут измеряться в процентах от каждой клеточной популяции.

Следуя приведенной выше методике, мы оценим экспрессию перфорина в нейтрофилах и клетках LGL и экспрессию гранзимов в нейтрофилах и клетках LGL как при обострении, так и при стабильной ХОБЛ.