咖啡对 HCV 相关性肝炎的影响

患者 40 名帕多瓦门诊胃肠病科的 HCV 相关慢性肝病患者将被前瞻性招募并进入研究。

在所有患者中，抗 HCV 抗体的存在将通过第三代免疫酶测试（Ortho Diagnostic Systems，Raritan，NJ）和确认测试（重组免疫印迹分析，Chiron Corp.，Emeryville，CA）进行分析。 将使用标准化的基因分型测定（Inno-Lipa HCV III，Innogenetics，Gent，Belgium）。

仅招募符合以下纳入标准的患者：

• HCV 相关的慢性肝炎或肝硬化，经活检（在过去 24 个月内）确认或在肝硬化的情况下进行临床诊断； （凝血酶原时间 - PT，白细胞 - WBC 和血小板 - PLT，超声 - 美国检查）；
• 抗-HCV 和 HCV-RNA 阳性，天​​冬氨酸氨基转移酶 (AST)/丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 至少 1.5x；
• 年龄范围30-80岁；
• 没有正在进行的干扰素治疗，既往治疗无反应或复发。

该研究经医院伦理委员会 (Prot. 1755 P, Azienda Ospedaliera di Padova)，患者的参与是自愿的，每位患者都签署了参与的知情同意书，并向每位患者的主治全科医生发送了一份信息说明。

在干预阶段开始之前，将收集每位患者的人口统计数据，以及有关咖啡和吸烟习惯、酒精、水果、蔬菜、消炎药消耗、能量和营养摄入的信息，作为潜在的偏差。 所有这些数据都将使用专为本研究设计的数量-频率问卷进行评估。 在时间 0 (T0)，患者将根据他们的日常咖啡摄入量分为两组：0-2 杯/天和 3-5 杯/天。 选择这个截止点是因为在大多数论文中观察到咖啡消费的影响超过 2 杯/天。

受试者将被要求在整个研究过程中保持他们的饮食和享乐习惯，同时禁止使用其他含咖啡因的饮料。

研究的试验设计

将在研究开始时 (T0) 对患者进行所有标记物的调查，然后使用计算机生成的列表（StatsDirect 统计程序）将患者随机分为两组，每天摄入 4 杯咖啡，持续 1 个月或戒断同一时间段。 显然，盲法是不可能的，我们决定不规定任何洗脱期，作为与患者常规咖啡消费相关的 T0 抽样检查。

30天后，将对患者进行重新测试，然后转移到相反的“治疗”（第一个月戒断咖啡的人进入咖啡组，反之亦然饮用咖啡的人）并在第二次后再次检查时期。

因此，每位患者在 T0 时、他/她进入研究时、喝咖啡后和戒酒后接受三次测试，让每位患者在两个阶段中控制自己。 为了简单起见，将在饮用咖啡后获得的所有数据与戒断期间获得的所有数据进行比较，而不管接触/戒断的时间顺序如何。

考虑到（根据已公布的数据）至少 40% 的暴露受试者预期有咖啡效应，1 个病例对照，5% α 误差和 80% 的功效，所需的样本量（20 个病例和 20 个对照）对应于为研究选择的样本。 此外，在这项研究中，考虑到交叉设计，其中每位患者接受两次调查，一次是在接触咖啡期间，一次是在戒酒期间，因此实际调查的患者人数为每组 40 人，因此是所需人数的两倍。

将向患者提供一份表格，在该表格中他们记录了关于咖啡摄入量的任何偏差和依从性以及适当的电话联系以立即报告任何副作用。 为了降低因咖啡制备过程中的个体差异而导致的任何偏差的风险，将为患者提供典型的意式炉顶式咖啡机 (MokaTMBialetti)，制备所需的咖啡量每天 4 杯咖啡（每次咖啡冲泡 8 克）以及如何冲泡的说明。

该咖啡品牌是 100% 阿拉比卡咖啡现成产品。 我们还想分析我们使用的产品。 分析将由合同实验室（Eurofins analytic GmbH - 德国汉堡）进行。

指示患者不要喝任何不同制备的咖啡，并且必须以适当的形式报告与研究的任何偏差。

方法 收集血液样本并在-20°C 下保存不超过 3 周。

在这项研究中，将评估以下参数：

1. AST/ALT、γ-谷氨酰转肽酶 (γGT) 和碱性磷酸酶 (ALP) 水平；
2. 病毒载量（HCV-RNA滴度），
3. 氧化损伤标志物：8-羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG)、一氧化氮 (NO)、高级氧化蛋白产物 (AOPP)、
4. 基因组稳定性的标记：端粒长度（TL），
5. 细胞死亡标志物：M30 和 M30/M65，
6. 肝纤维化和血管生成的标志物：III 型前胶原 (PIIINP) 和血管内皮生长因子 (VEGF)。

肝功能测试测定 AST 和 ALT、γGT 和 ALP 的血清水平将作为常规临床程序的一部分进行测定。

HCV-RNA 测定 将通过用 PCR 扩增 HCV 的 5' 非翻译区 (5'-UTR)（病毒最保守的区域）来评估血清中 HCV-RNA 的存在。 该测试在所有抗 HCV 抗体呈阳性的受试者中进行（筛选测试）。 扩增将通过“巢式 PCR”分两步进行。

8-OHdG 测定 该测定将按如下方式进行：简而言之，该测定包括 3 个步骤：(i) 使用 Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒（Promega Italia，米兰）提取基因组 DNA； (ii) DN​​A 的核酸酶 P1 和碱性磷酸酶水解； (iii) 使用配备电化学检测器的 HPLC (HPLC-ED) (ESA Coulochem II 5200 A, Bedford, MA) 测定 8-OHdG。 8-OHdG 水平表示为 8-OHdG 加合物数/105 dG。

NO 测定 血清 NO 水平将通过测量其稳定降解产物硝酸盐和亚硝酸盐（牛津生物医学研究，美国）的积累来分光光度法测定。 NO 水平将表示为 µmol/L，作为一氧化氮合酶激活和亚硝化的标志。

AOPP 测定血浆 AOPP 水平将通过 Witko-Sarsat 执行的分光光度法测量。 AOPP 浓度表示为 µmol/L 的氯胺-T 当量。

通过定量 PCR 进行 TL 分析提取的基因组 DNA 也将用于通过使用 Cawthon 开发的方法来测量 TL。 为每个实验准备了两个 96 孔板，一个包含端粒引物，另一个用于 36B4，编码酸性核糖体磷蛋白 P0 作为单拷贝基因。

每个 25 µl PCR 反应包含 40 ng DNA、SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，Foster City，CA）和引物，最终浓度分别为 270 nM Tel-1 和 900 nM Tel-2 或 300 nM 36B4u 和 500 nM 36B4d。

PCR 扩增在 ABI PRISM 7900 (Applied Biosystem) 中进行。 在每块板中，生成 4 至 80 ng 人类参考 DNA（Applied Biosystem）的标准曲线。 端粒扩增的热循环曲线是 95°C 10 分钟，然后是 95°C 5 秒、56°C 10 秒和 72°C 60 秒的 30 个循环或 95°C 5 秒的 30 个循环s，58°C 持续 10 s，72°C 持续 40 s。 扩增后，进行解离曲线以确认反应的特异性。 所有样品一式三份进行测定以测试测定的再现性，并且在每个测定中评估阴性对照。

通过 ABI 7900 SDS 2.3 软件分析荧光信号和解离曲线。

细胞死亡测定 M30-Apoptosense ELISA（Peviva，美国）是一步体外免疫测定法，用于定量测定血浆中细胞凋亡相关的 CK18Asp396 (M30) 新表位。 量化正在进行的凋亡细胞死亡的抗原浓度，表示为 U/L。

M30-Apoptosense ELISA 与 M65 ELISA（Peviva，美国）结合使用，用于定量测定死细胞（坏死和凋亡）释放的总可溶性 CK18。 抗原的浓度表示为 U/L。

PIIINP 和 VEGF 测定血浆 PIIINP 水平将使用 ELISA 试剂盒（USCN，中国）测定。 PIIINP 水平表示为 ng/mL，作为组织胶原沉积和纤维化的标志。 使用 ELISA 试剂盒（Bender MedSystems，奥地利）将血清 VEGF 确定为新血管生成和组织重塑的标志物，数据以 ng/L 表示。

统计数据将使用单向方差分析、配对 t 检验、未配对数据的学生 t 检验、线性回归（SPSS、STATSDIRECT）进行分析，统计显着性设置为 p <0.05（2 尾）。 所有关于接触咖啡和戒除咖啡的比较都将在患者内部进行，而不是在群体内部进行，如前所述，使用配对数据方法。